家蚕及家蚕杆状病毒类泛素化（SUMO）修饰研究

类泛素化修饰（SUMO）蛋白是一种新发现的翻译后修饰蛋白，通过可逆地与底物结合参与靶蛋白的定位及复杂的调节功能，涉及转录调节、DNA修复、新陈代谢、离子转运、能量产生等一系列过程，与病毒侵染复制也有重要关系。本研究以鳞翅目昆虫代表种-家蚕为研究对象，克隆家蚕SUMO化途径参与的各个基因，建立适合家蚕研究的体外SUMO化系统，同时通过酵母双杂交、PULL-DOWN和免疫沉淀筛选底物蛋白。根据我们前期工作结果和文献报道，在筛选过程中附加家蚕杆状病毒为研究对象，主要手段为：酵母双杂交时用病毒侵染细胞RNA构建表达文库；PULL-DOWN和免疫沉淀时用杆状病毒表达载体过量表达SUMO和UBC9后的总蛋白来作为筛选对象。本研究的目的在于建立体外SUMO化系统，获得家蚕和杆状病毒中被SUMO化修饰的靶蛋白，阐明若干条家蚕或杆状病毒蛋白被SUMO化修饰后产生影响的途径。

类泛素化修饰（SUMOylation）是一类重要的蛋白质翻译后修饰机制，调节许多生物过程，比如：、蛋白识别、细胞分化、转录活性、信号传导等。为了了解类泛素化修饰在鳞翅目昆虫代表种-家蚕-中的作用和功能，本课题研究了外源刺激对家蚕类泛素化系统的影响，家蚕和家蚕杆状病毒（BmNPV）类泛素化修饰底物筛选和鉴定等内容。主要结果如下：(1)BmNPV感染BmN细胞后，家蚕SUMO化相关基因表达量明显增加；同样蚕体内注射 BmNPV 和大肠杆菌也获得了相似的结果，表示SUMO化修饰参与了BmNPV的感染复制和对外源侵入的应激反应；(2)RNAi干扰实验表示SUMO化修饰参与了家蚕的胚胎发育调控；（3）构建了eGFP-SUMO重组病毒表达质粒，免疫沉淀后通过质谱技术获得了68个家蚕SUMO化底物蛋白和14个BmNPV蛋白。通过免疫共沉淀验证了家蚕的4个蛋白确实能够被SUMO化修饰。同时在本基金的资助下也取得了其他一些结果：（1）通过酵母双杂交和荧光双分子互补证实BmNPV早期蛋白PE38与家蚕丝氨酸 /精氨酸剪接因子蛋白激酶（serine/arginine rich splicing factor protein kinase，SRPK）和真核生物翻译起始因子（eukaryotic initiation factor 4E， eIF4E）存在相互作用；（2）BmNPV感染BmN细胞会引起聚集体的产生，聚集体与HSC/HSP7、泛素、线粒体共定位在一起，一些BmNPV蛋白如（polyhedrin，GP64, Bm101, Bm56 和 Bm75）能够形成聚集体，并且多角体蛋白在聚集体中的含量随感染时间的增加而减少；（3）数字基因表达谱（DGE）技术研究了家蚕微孢子虫感染家蚕早期的基因变化，结果显示家蚕微孢子影响了家蚕许多重要的生物过程，比如：感叶酸合成，烟酸和烟碱代谢，蛋白加工、转运，溶酶体产生，氨基酸合成，核糖体，RNA降解等。