转录因子HB4在柑橘体细胞胚发生过程中的功能解析

Somatic embryogenesis (SE) plays an important role in vitro regeneration process which is the key step in vitro germplasm conservation and genetic improvement via biotechnological approaches in citrus. In our previous work, three suppression subtractive hybridization (SSH) libraries were constructed using different stage calluses of Citrus sinensis cv. 'Valencia' to explore the molecular mechanisms that underline the SE in citrus.One transcription factor encoding a homeobox-leucine zipper domain protein was identified.The analyses results of qRT-PCR and SSR indicated that this gene might be involved in the regulation of SE process.In order to understand the function and regulatory mechanism of the transcription factor in acquisition of embryogenic competence and somatic embryo development,we use the overexpression and RNA interference (RNAi) technologies to reveal this gene function, moreover we try to detect its target gene using ChIP-seq and EMSA technologies. Results of these analyses not only enrich the understanding of transcriptional regulatory theory, but also in application value in citrus genetic improvement.

体细胞胚发生是柑橘愈伤组织离体培养获得再生植株的最主要途径，在柑橘种质资源的离体保存和遗传改良中发挥着重要的作用。我们在前期柑橘体细胞胚发生的研究中，利用伏令夏橙不同发育阶段的愈伤材料构建了三个抑制性差减杂交（SSH）文库，经Microarray筛选，鉴定出一个具有Homeobox和Leucine Zipper结构域的转录因子，实时定量PCR和SSR分析结果显示该基因可能参与了柑橘体细胞胚发生的调控。为了探明该基因在柑橘胚性能力的获得和体细胞胚发育过程中的确切功能，本项目拟通过超量表达和RNA 干涉技术在柑橘上开展基因功能研究，利用染色质免疫共沉淀-深度测序（ChIP-seq）和凝胶阻滞（EMSA）技术分离该转录因子调控的靶基因，深入理解该转录因子在柑橘体细胞胚发生过程中的功能。

本课题以具有强体细胞胚发生能力的伏令夏橙愈伤为研究试材，以从中分离鉴定出的具有Homeobox和Leucine Zipper结构域的转录因子CsHB4为研究对象，研究计划主要包括CsHB4基因在柑橘体细胞胚发生过程中的表达分析，CsHB4转基因材料获得及其表型鉴定，CsHB4基因启动子的克隆和表达分析，下游靶基因的分离鉴定。研究结果表明：①在具有强体细胞胚发生能力的愈伤组织中CsHB4基因的表达量明显的高于体细胞胚发生能力弱的品种；②在18个柑橘不同品种基因型中，SSR位点(TCG)n的存在与柑橘不同基因型体细胞胚发生过程中胚性能力的获得存在明显的相关性；③筛选获得27个国庆一号转基因株系，选取其中7个转基因系继代到甘油培养基中，5个转基因系愈伤均呈现出绿色，其中2个转基因系出现了绿色的胚状体；④通过qRT-PCR检测，CsHB4基因在超量表达愈伤系中的表达水平较野生型均有不同程度的上调；同时分析了甘油培养基诱导5w的超表达转基因愈伤材料的叶绿素含量，其叶绿素含量明显的高于野生型对照；⑤细胞学分析显示相较于国庆一号愈伤组织具有的液泡大、细胞质染色浅、相对成熟的细胞状态，国庆一号转基因愈伤组织材料细胞质染色深，淀粉粒、蛋白体多，有叶绿体的分化，呈现出活跃的代谢状态；⑥分离并鉴定CsHB4启动子存在两种类型，时空表达分析结果表明，在T3代转基因拟南芥的花药和愈伤中检测到GUS的表达活性。本研究获得了胚性发生能力改变的国庆一号转基因愈伤材料，分析了其表型、细胞学和生理生化的变化，探明该基因在柑橘胚性能力的获得和体细胞胚发育过程中的确切功能。