猪瘟病毒NS4A蛋白诱导细胞凋亡的机制研究

Classical swine fever virus (CSFV) NS4A is essential for the formation of infectious CSFV particles. However, the effect of NS4A on host cells are still unknown. Studies have confirmed that CSFV NS4A could induce cell apoptosis in PK-15 cells, but the underlying mechanism remains poorly understood. Based on our previous study, this study will determine the signaling pathway of that NS4A induces cell apoptosis. The “strategic proteins” that interacting with NS4A will be screened by tandem affinity purification and MS. In addition, the key domain and amino acid of NS4A that interacting with “strategic proteins” will be confirmed. Moreover, the mechanism will be studied to explain how NS4A regulates cell apoptosis through “strategic proteins” by CRISPR/Cas9 technology. Finally, the form of constitution of NS4A, the stability of NS4A and the effect of some CSFV proteins on NS4A-induced apoptosis will be explored to explain how CSFV infection antagonizes NS4A-induced apoptosis. The results will provide new theoretical foundation for the role of NS4A in CSFV pathogenesis.

猪瘟病毒（CSFV）NS4A蛋白对CSFV感染性病毒粒子的形成极其重要，但NS4A蛋白对宿主细胞有何影响仍不清楚。我们研究发现CSFV NS4A蛋白在猪肾细胞（PK-15细胞）中表达可诱导细胞发生凋亡，但其调控细胞凋亡的机制还不清楚。本项目拟在前期研究基础上，查明NS4A诱导细胞凋亡的信号通路，应用串联亲和纯化和质谱鉴定等技术筛选出与NS4A蛋白相互作用的“关键蛋白”，并确定NS4A蛋白中与“关键蛋白”结合的关键区域和位点。用CRISPR/Cas9敲除技术明确NS4A蛋白通过“关键蛋白”调控细胞凋亡的具体机制。同时，通过分析NS4A主要的存在形式、NS4A蛋白的稳定性以及CSFV其他蛋白对NS4A诱导细胞凋亡的影响这3种途径，进一步阐明CSFV感染细胞的过程中拮抗NS4A诱导的细胞凋亡的机理，为揭示NS4A蛋白在CSFV致病机制中的作用提供新的理论依据。

在CSFV感染过程中，NS4A作为辅助因子，通过与NS2-3或NS3相互结合，在病毒颗粒形成中发挥作用。然而，关于CSFV NS4A蛋白功能的研究很少。本项目旨在完善CSFV NS4A蛋白在病毒感染过程中的功能和作用，明确CSFV NS4A蛋白对细胞凋亡的影响，分析CSFV NS4A蛋白对宿主细胞生理功能的影响，寻找与NS4A互作的细胞蛋白，确定CSFV NS4A的主要存在形式及稳定性，筛选抗病毒蛋白，阐明NS4A蛋白促进CSFV的复制机制。研究结果表明，NS4A虽能上调eIF2α/ATF4/CHOP凋亡通路中ATF4蛋白的表达以及p53/Bax/caspase 9/caspase 3凋亡通路中p53和Bax蛋白的表达，但对关键的凋亡蛋白caspase 9和caspase 3蛋白的表达无影响；通过RNA-seq发现CSFV NS4A能够引起细胞内1987个基因上调，1906个基因下调，NS4A影响细胞粘附、细胞凋亡、宿主防御反应、炎症反应、免疫反应和自噬等细胞的生理进程；利用免疫共沉淀（Co-IP）和液相色谱-串联质谱（LC⁃MS/MS）技术筛选与NS4A结合的细胞蛋白1845个，这些蛋白参与细胞、细胞部分、细胞内进程、结合、代谢、内吞、免疫系统进程、细胞增殖、细胞凋亡和细胞连接等生物过程；制备NS4A蛋白2株单克隆抗体3A11和6F1，发现NS4A蛋白在CSFV感染过程中主要以单体形式存在，是一种不稳定的蛋白；CSFV NS4A能抑制多种潜在的具有抗病毒活性的基因的表达，其中IFITM1和TRIM25具有抑制CSFV复制的作用，而NS4A蛋白能促进CSFV的复制；进行了猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区（E2t）的原核表达，筛选出E2t蛋白可溶性的最佳诱导条件；制备MAVS多克隆抗体，发现CSFV感染能促进MAVS蛋白的表达。.综上所述，本研究通过实验发现CSFV NS4A蛋白不能诱导细胞发生凋亡，能够影响细胞粘附、细胞凋亡、宿主防御反应、炎症反应、免疫反应和自噬等细胞的生理进程，能够与内吞、免疫系统进程、细胞增殖、细胞凋亡和细胞连接等生物过程中的多种蛋白发生互作，NS4A蛋白在病毒感染中主要以单体形式存在且不稳定，可以通过抑制抗病毒蛋白的表达从而促进CSFV的复制。本研究完善了NS4A蛋白在病毒感染过程中的功能和作用，为阐明CSFV的致病机制提供新的理论依据。