基于生理电场诱导神经分化的bHLH转录因子网络调控模式的研究

Directed neuronal differentiation of neural stem cells is one of the most challenging aspects of neuroregenerative medicine. Our previous experiments have confirmed that electric fields (EFs) activate voltage-sensitive gene PI3K, which phosphorylates GSK-3β and leads to increased intracellular level of β-catenin. Thus, it enhances the expression of bHLH transcriptional factors to induce the neuronal differentiation. And identifying the regulatory pattern of bHLH transcriptional network in the process of EFs induced neuronal differentiation remains elusive. To study this question, we plan to use multiple tools including the gene knockout, siRNA gene silencing, gene overexpression and time-lapse live-cell imaging to investigate the expression dynamics and inter-relation of bHLH transcription factors Ascl1, Hes1, Oligo2 , Ngns and NeuroD1 in EFs induced neuronal differentiation. We provide an integrated view of intrinsic mechanism of EF modulated neuronal differentiation. In addition to the basic scientific research data, the objectives proposed might also lead to determination of potential electric signals treatment in neuroregenerative medicine, thus providing substantial benefits for further investigations and the clinics.

调控神经干细胞(NSCs)定向分化为神经元是神经再生医学应用中的难题。我们前期研究发现生理电场（EFs）通过电压敏感性基因PI3K激活AKT/GSK3-β/β-Catenin 信号途径促进bHLH 转录因子Ngn3/NeuroD1的表达而诱导神经分化。但NSCs的多向分化潜能决定调控其分化方向的bHLH转录因子是一个精确而复杂的网络，因此探讨bHLH转录因子网络的调控模式是阐明EFs诱导神经分化作用机制的关键。本项目拟利用基因敲除、siRNA沉默、基因过表达、活细胞成像等技术，通过对Ngn3上游基因 Ascl1功能缺失和重建的研究，以及对 bHLH 转录因子Ascl1、Hes1、Oligo2、Ngns及NeuroD1在EFs诱导神经分化过程中的动态表达和相互关系的分析，阐明EFs诱导神经分化的作用机制，为生物电信号在神经再生中的应用提供理论依据。

生理电场（EFs）已被证明可通过诱导神经干细胞（NSCs）的定向迁移和分化等细胞行为促进神经发生。我们前期以电压敏感性基因PI3K为切入点，阐明了生理电场激活的PI3K/AKT通过GSK-3β与Wnt/GSK-3β/β-catenin发生Crosstalk，促进了β-catenin在细胞内的累积而诱导神经分化。但NSC的多潜能分化属性，决定了调控其分化方向的bHLH转录因子是由维持NSCs自我更新的负调控因子、促进神经元分化的正调控因子与胶质细胞分化基因构成的精确而复杂的网络。因此，探讨生理电场刺激NSCs向神经元分化过程中，bHLH转录因子网络的调控模式成为阐明生理电场诱导神经分化作用机制的关键。为阐明这一机制，我们通过以下研究对bHLH转录因子Ascl1，Hes1，Oligo2，Ngns及NeuroD1在EFs诱导神经分化过程中的动态表达进行了分析，解析基于生理电场诱导神经分化的bHLH转录因子网络的调控模式：.（1）通过药物抑制、siRNA沉默等技术在细胞水平分别进行了PI3K、β-catenin和Ascl1 的Loss-of-function的研究，明确了Ascl1的稳定持续表达与生理电场激活的PI3K，β-Catenin密切相关；.（2）应用蛋白与蛋白相互作用网络分析，进一步明确了转录因子Ascl1是调控生理电场诱导神经分化的关键蛋白；.（3）在mRNA和蛋白水平证明了Ascl1的稳定持续表达是生理电场诱导的神经分化所必需的；.（4）应用Western-blot、免疫荧光化学染色与内源性启动子荧光融合实验等技术检测NSCs中Hes1，Ascl1以及Oligo2，在生理电场作用下随时间表达的变化模式；证明了EF通过促进Ascl1的稳定增加和对Hes1表达的抑制而诱导神经分化；.（5）应用免疫荧光化学染色和siRNA沉默技术，证明了施加生理电场后Ascl1-EGFP-NSCs细胞中Ngn1/Ngn2/Ngn3的表达与Ascl1的持续稳定表达具有相关性。.上述结果证明了生理电场的刺激打破了bHLH转录因子网络在NSCs中的表达平衡，促进Ascl1的持续表达进而促进Ngns和NeuroD1的表达，并最终决定细胞向神经元分化。本研究为建立创新型生物医学方法治疗神经系统疾病提供理论与实验依据。