生理电场通过电压敏感性基因 PI3K 调控 Wnt/β-Catenin 通路诱导神经分化

One of the greatest challenges that neuroregenerative medicine encounters is directing stem cells differentiate toward neurons. Our preliminary experiments showed that EFs could stimulate embryonic neural stem cells (eNSCs) differentiation into neurons. Based on our pivotal experiments which exhibited PI3K P110γ-/- NSCs lost neuronal differentiation tendency in EFs, we elicit concerns on voltage-sensitive gene PI3K to clarify signalling pathway in the regulation of neuronal differentiation in EFs. The gene knockout and drug inhibition techniques are used to carry on association studies of PI3K/AKT regulated EFs-stimulated neuronal differentiation; siRNA gene silencing is used to investigate if β-Catenin accumulation is necessary for PI3K/AKT regulated EFs-stimulated neuronal differentiation. To provide an integrated view of intrinsic mechanism of EF modulated neuronal differentiation, we plan to clearly state 2 key points in one year: PI3K/AKT activity associates with EFs stimulated neuronal differentiation and accumulation of β-Catenin is necessary. The objectives proposed lead to determination of intrinsic mechanism of EF modulated neuronal differentiation for further research.

干细胞在神经再生医学中的应用面临的最大挑战之一就是如何调控其分化为神经元。本项目拟在前期工作已证明PI3K基因敲除抑制生理电场（EFs）诱导的胚胎神经干细胞（eNSCs）神经分化的基础上，计划以 eNSCs 为细胞模型，首先通过基因敲除与药物抑制阻断 PI3K 的活性，应用Western-blot 与免疫细胞化学染色等技术明确 PI3K/AKT 活性与 EFs 诱导的神经分化的相关性；同时应用 siRNA 沉默技术沉默 eNSCs 内 β-catenin 的表达，应用免疫细胞化学染色等技术初步明确 β-catenin 的细胞内累积与 EFs 诱导的神经分化的相关性。通过本项目的研究，我们拟明确2个关键点：确定 EFs 激活的PI3K/AKT 活性与神经分化诱导的相关性以及β-catenin 在细胞内的累积是否是 EFs 诱导神经分化所必需的，为进一步阐明 PI3K/AKT 与 Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号传导通路在 EFs 诱导的神经分化过程中的调控机制提供关键实验依据。

干细胞在神经再生医学中的应用面临的挑战之一就是如何调控其分化为神经元。课题组在前期工作中证明生理电场（EFs）可定向诱导小鼠胚胎干细胞（ESCs）和胚胎神经干细胞（eNSCs）向神经元分化。生理EFs在干细胞分化微环境中的神经诱导作用给再生医学带来新机遇，而阐明生理EFs诱导神经分化的调控机制将促进其在神经再生医学中的应用。课题组已证明PI3K基因敲除抑制生理EFs诱导的神经分化。本研究在前期工作基础上，以电压敏感性基因PI3K为切入点，通过基因敲除、siRNA沉默、以及药物抑制等不同途径对PI3K/AKT与Wnt/GSK-3β/β-catenin信号传导通路分别进行Loss-of-function的研究。应用Western-blot检测PI3K/AKT与GSK-3β/β-catenin的表达和磷酸化水平；应用免疫细胞化学染色检测eNSCs在生理 EFs 中不同条件下的神经分化情况。结果表明生理EFs激活的PI3K活性与生理EFs诱导的神经分化密切相关； PI3K /AKT 的激活通过促进GSK-3β的磷酸化而增加了下游蛋白β-Catenin 在细胞内的累积，而β-Catenin 在细胞内的累积是生理EFs 诱导的神经分化所必需的；β-Catenin 在细胞内的累积激活β-Catenin下游 bHLH 基因Ngn3和NeuroD1的表达，促进了eNSCs向神经元的分化。上述研究结果证明了我们的科学假设：在生理 EFs 刺激的神经分化过程中，PI3K/AKT 与Wnt/GSK-3β/β-catenin发生 Crosstalk：生理 EFs 激活 PI3K/AKT,使GSK-3β 磷酸化而失活，促进 β-catenin 的稳定并在核内累积，调控 bHLH 基因Ngn3和NeuroD1表达，促进 eNSCs 向神经元的分化。