支持细胞对抗体内吞的特异性抑制可提高免疫避孕效率的研究

世界人口迅速增长，避孕更需要男性发挥积极作用。然而有效的男性避孕药物研发，至今尚无突破性进展。有研究证实，附睾蛋白酶抑制剂（epididymal protein inhibitor, EP）疫苗免疫雄猴获得较好避孕效果，极可能成为开发男性避孕药物的靶点。本室在研发该蛋白疫苗中发现①提高精浆中抗体浓度可抑制精子动力，是提高免疫避孕效率的关键；②睾丸支持细胞内吞EP抗体，减少抗体进入精浆，但作用靶点尚待明确。本课题拟从细胞水平，通过shotgun结合质谱技术鉴定特异性内吞受体，软件筛选受体上负责内吞的肽段，进而通过siRNA干扰验证该肽段的特异性；制备特异内吞肽段的抗体，结合睾丸显微注射，证明该肽段内吞功能被抑制后可有效提高精浆中抗EP抗体浓度。本研究可为男性融合避孕疫苗提供新的靶点。

目的：本课题组前期研究发现支持细胞对抗EP抗体有内吞现象。通过本项目的实施寻找参与内吞EP抗体的蛋白靶点，并通过干预该靶点达到提高精浆中的EP抗体滴度，从而提高免疫避孕效率。方法：从细胞水平，通过EP抗体与睾丸支持细胞共孵育30min与4h后，通过shotgun结合LC-MS-MS质谱技术寻找并鉴定特异性内吞受体；通过小鼠活体成像技术来观察给予抗EP抗体是否会影响Mtmr3的定位或功能；在小鼠原代sertoli细胞培养基内加入Mtmr3抗体封闭Mtmr3过夜，通过免疫荧光染色实验观察sertoli细胞对EP抗体的内吞作用是否有变化；将Mtmr3蛋白与EP蛋白，进行分组和动物免疫，并检测静脉血中产生的相应抗体滴度的变化；将部分免疫小鼠进行交配实验，观察混合蛋白免疫后的避孕效率；取剩余免疫小鼠一侧睾丸及附睾进行病理检测；一侧取睾丸进行TJs各组分蛋白磷酸化水平检测，取附睾液及精子进行ELISA和CASA检测。结果：支持细胞特异性内吞EP抗体（对其他抗体未发现内吞现象），并且随时间延长内吞越明显；通过shotgun结合LC-MS-MS质谱技术寻找并鉴定特异性内吞受体Mtmr3；而小鼠尾静脉注射抗EP抗体后，发现小鼠睾丸中Mtmr3的定位发生改变；并且，当加入Mtmr3抗体后，支持细胞对EP抗体的内吞被减弱；通过混合免疫Mtmr3蛋白与EP蛋白后，发现混合免疫组小鼠避孕效率、附睾液中抗EP抗体滴度,精子活力下降程度均高于单独免疫EP蛋白组小鼠,；各组小鼠的附睾、睾丸未发现病理性改变；电镜结果显示TJs部位的超微结构未见异常；TJs部位的部分蛋白如Occludin，Claudin，ZO-1，JAM磷酸化水平发生改变。结论：Mtmr3蛋白确实与支持细胞内吞抗EP抗体有关；与单独免疫EP蛋白组相比，混合免疫Mtmr3蛋白与EP蛋白后，小鼠附睾液中抗EP抗体滴度升高，精子活力下降，免疫避孕效率提高，并且小鼠未出现TJs超微结构异常；TJs部位的部分蛋白如Occludin，Claudin，ZO-1，JAM磷酸化水平发生改变可能与上述结果有关，但具体机制仍待进一步研究。