基于活细胞实时成像术研究dynamin调控囊泡半融合的机制

The membrane of eukaryotic cells, such as plasma membrane, vesicle membrane, etc., is composed of lipid bilayer. The fusion between membrane structure is fundamental and crucial biological process. Previous studies indicated the presence of hemifusion intermediate during the vesicle fusion with plasma membrane, that is, the outer leaflet of vesicle membrane fused with inner leaflet of plasma membrane without the content mixing. Current understanding of the hemifusion are mostly derived from in vitro assays using artificial liposomes, however, the evidence of hemifusion in eukaryotic cells are still missing so far. Using whole-cell patch clamp, together with confocal and super-resolution imaging, we identified the hemifusion intermediate between large-dense core vesicles and plasma membrane in live cells, i.e., primary cultured bovine chromaffin cells. We also found hemifusion in live cells is associated with Ca2+ influx and dependent on the activity of dynamin. In this project, we will further explore the mechanism how Ca2+ influx could induce dynamin activation and characterize the key structural domain in dynamin essential for controlling hemifusion occurrence. The interacting protein of dynamin associated with hemifusion will be identified. Thus, a novel dynamin-dependent signaling pathway regulating hemifusion will be raised and the understanding of membrane fusion in eukaryotic cells will be advanced by this study.

真核细胞的生物膜（如细胞膜，囊泡膜等）均由脂质双层构成，生物膜结构之间的融合是基础而重要的生物学过程。研究显示，在分泌囊泡释放过程中，在囊泡膜与细胞膜完全融合之前，可能存在半融合（hemi-fusion）状态，即囊泡膜外层与细胞膜内层已经融合而分泌小孔却未开放。目前对半融合的研究大多局限于人工合成的脂质小体，真核细胞中是否存在半融合仍缺乏证据。利用全细胞膜片钳结合显微实时摄影术，申请者在活细胞（原代培养嗜铬细胞）中首次获得分泌囊泡与细胞膜间的半融合的可靠证据，并发现该过程依赖于钙离子和dynamin。本项目拟利用该实验体系，解析钙离子如何引起dynamin活化并确定dynamin分子中参与调控半融合的关键位点，鉴定与dynamin结合并影响半融合的辅助因子，从而阐明dynamin调控半融合的分子机理。本项目将揭示一条新的dynamin调控半融合的信号通路，推动对真核细胞中膜融合过程的认识。

囊泡与质膜的融合与分裂是真核细胞中重要而基础的生物学过程，但其调控机制及病理意义有待阐明。本课题在前期工作基础上，拟探讨dynamin亚型在囊泡与质膜融合及分裂过程中的作用，并进一步解析dynamin亚型在囊泡与质膜的半融合及半分裂过程中的作用及其机制。目前的主要研究进展为：（1）建立了在血管内皮细胞中分析囊泡与质膜融合及分裂的实验体系，发现dynamin II亚型是血管内皮细胞中呈高表达的主要亚型；（2）建立了对不同亚型的dynamin进行单独及联合敲降的体系，发现dynamin亚型之间存在相互表达调控机制；观察到dynamin II亚型与笼格蛋白（clathrin）呈明显共定位；（3）透射电镜分析发现dynamin II参与了囊泡从质膜分裂并脱离的过程；（4）利用构建的体外血脑屏障模型，发现dynamin II参与了beta-淀粉样蛋白的内吞过程；（5）发现dynamin可能和Caspr1结合，且在大肠杆菌被内皮至真核细胞并形成含菌囊泡的过程中，我们发现宿主的Caspr1膜蛋白是真核细胞内吞大肠杆菌的宿主受体（Nature Communications. 2018. 12;9:2296. 第一作者及共同通讯作者）。该研究首次在体内鉴定了大肠杆菌侵袭和穿过血脑屏障所必需的新受体Caspr1，为制备阻断药物提供了可靠的分子靶标；（6）相关的探索性研究发现，Caspr1能够调控钠钾泵的质膜定位（J Biol Chem, 2019. 294 (16): 6375-6386；共同通讯作者）；Caspr1也能通过调控alpha分泌酶ADAM9来促进sAPP-alpha的生成（Front Mol Neurosci. 2020; 13: 23；共同通讯作者）。