酪蛋白源ACE抑制肽的Plastein反应修饰与机制

利用特异性不同的三种蛋白酶分别对酪蛋白进行水解制备ACE抑制肽，通过相应蛋白酶催化的Plastein反应修饰ACE抑制肽并表征修饰产物的ACE抑制活性，剖析修饰反应改变ACE抑制活性的内在机制。研究应用响应面法优化蛋白酶在水介质中的Plastein反应条件（反应温度、底物浓度、酶添加量、介质pH等），研究修饰反应的条件效应对修饰产物ACE抑制活性的影响；通过分析修饰产物中肽分子组成变化、末端氨基酸组成变化以及抑制活性变化，剖析蛋白酶特异性对它们的影响模式，确定实际的反应历程；结合蛋白酶特异性、反应进程、修饰产物肽分子组成和末端结构变化、修饰产物抑制活性变化，揭示并建立建立酪蛋白ACE抑制肽Plastein反应修饰与抑制活性变化的理论机制。

ACE抑制肽（降压肽）是对模型动物具有降压作用生物活性肽，是潜在的功能性食品原料。本课题研究工作是利用plastein反应对酪蛋白源ACE抑制肽进行修饰，响应面法优化碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等催化反应时的修饰条件，评估蛋白酶、修饰反应程度、外源氨基酸添加对ACE抑制肽活性影响作用，建立相应的反应机制（肽分子重组）；确定醇-水介质中修饰反应以及外源性氨基酸添加对ACE抑制肽活性的影响，以及基于醇-水体系分级处理对ACE抑制肽活性的影响。研究发现，水相的plastein反应修饰4-6 h，由于缩合作用和转肽作用，肽分子重组导致生成高活性的新肽分子，从而显著地提高修饰产物的体外活性、尤其是酶抗性，活性提高1倍以上，修饰产物经过酶解后其残余活性仍然高于酪蛋白ACE抑制肽原料；疏水性氨基酸尤其是脯氨酸的添加，极大地提高了修饰产物的活性；利用乙醇-水（70:30，v/v）可以将修饰产物分级为沉淀、上清两部分，上清部分具有更高的活性以及富含疏水性氨基酸。乙醇-甲醇或丙醇-水体系中的短时间plastein反应，导致修饰产物适宜的反应程度和增强的ACE抑制活性，过长的plastein反应则导致修饰产物过大的反应程度和降低的ACE抑制活性，与抑制肽的过度缩合反应有关。但是，醇-水介质中的plastein反应仍然提高了修饰产物的酶抗性。本研究工作的结果，为今后高活性、高稳定性ACE抑制肽的制备提供理论依据。研究工作同时还进行了拓展，确认了plastein反应对大豆蛋白ACE抑制肽的抑制活性，同样具有改善作用，并从另一方面进行一步证明：plastein反应对提高生物活性肽的活性有其重要利用价值。