酪蛋白ACE抑制肽的外源氨基酸导入及体内降压作用研究

Casein hydrolysates obtained from enzymatic hydrolysis of casein have ACE-inhibitory activity.It is an important issue in food science to prepare casein hydrolysates with better activity.In the present work, Plastein reaction is applied to enhance the ACE-inhibitory activity of casein hydrolysates. Two amino acids are incorporated into the peptides in the hydrolysates by the reaction, in order to reveal the impacts of Plastein reaction and amino acid incorporation on the in vitro activity of modified products. The optimal conditions and pathways would be determined，under which Phe and Ser are incorporated by the action of Alcalase. The in vitro activities, peptide composition and incorporated amount of the modified products are evaluated and compared with control reaction. The influences of the reaction , amino acids characteristics and incorporated amount of amino acids on the activity of the products are analyzed and compared. With multivariate analysis, a chemical mechanism would be established to explain the roles of the amino acid incorporated on ACE-inhibitory activities of the products. Model aminals are also used to show the practical biological impacts of the products in vivo, and the correlationship between the in vivo and in vitro results. The work could reveal the importance of Plastein reaction to the activity of biological peptides, and the results might provide an useful approach to give milk products much added-value.

酪蛋白酶经水解后水解物具有ACE抑制活性。进一步提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性，是食品科学研究的一个重要课题。本研究将利用Plastein反应，对酪蛋白ACE抑制肽进行酶催化修饰，在肽分子上导入2种外源性氨基酸，揭示修饰和氨基酸导入对ACE抑制活性的调控作用。通过优化反应途径与条件，利用碱性蛋白酶,在酪蛋白水解物中分别连接苯丙氨酸、丝氨酸，实现外源性氨基酸的酶促导入；评价修饰后产物的体外ACE抑制活性变化、肽组成变化、外源性氨基酸导入量，并采用多重分析确定修饰反应的反应进程、氨基酸属性、氨基酸导入量等对ACE抑制活性的调控作用，归纳外源性氨基酸导入对酪蛋白水解物的ACE抑制活性调控的化学机制。利用模型动物，评价氨基酸导入前后抑制肽在体内的实际作用效果，评估体内、体外结果的相关性。本研究对高活性生物活性肽的生产具有重要理论意义和应用价值。

研究利用中性蛋白酶水解牛乳酪蛋白获得水解物，经类蛋白反应分别在醇相和水相导入外源性氨基酸（亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸）获得的产物ACE抑制率显著增高，IC50降低显著。.研究表明各制备物（指三种类蛋白反应修饰产物）的ACE的抑制活性在不同温度（20-120C）、酸度（pH2~10）变化时稳定，且模拟消化实验后各水解物的ACE抑制活性的未减弱。 .酪蛋白水解物及类蛋白修饰产物对H2O2诱导人体脐静脉内皮细胞（HUPVC）氧化损伤模型的保护作用：类蛋白反应可有效降低各制备物的LDH渗出率、MDA生成量、SOD活力，与此同时可使GSH-Rd、CAT的活力显著增强，而细胞内GSH的含量变化不明显，说明对H2O2诱导的HUPVC损伤具有良好保护作用。.酪蛋白水解物及类蛋白修饰产物对SHR大鼠血压的影响：2h时口服各制备物与口服HC组差异显著(P>0.05)，经Plastein修饰后的酪蛋白水解物在SHR大鼠体内的降血压特性显著提高。 .酪蛋白水解物及类蛋白修饰产物的体内实验: 1）对体内肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用：试验组血清ACE、AngⅡ和醛固酮的表达水平低于阴性对照组，降低的最高比例分别为39.56%、39.60%和47.07%。SHR大鼠口服不同制备物后血清中ACE的水平与HC组相比分别降低28.64%、36.20%、29.23%和41.59%（P<0.5），各组的ALD的表达水平与HC组相比均显著下降（P<0.5），但与体外ACE抑制率的测定结果不一致。2）对体内氧化-抗氧化系统的影响：HC组和各制备物组的SOD的活力变化区间为85.54±4.25U/mL~88.89±5.32U/mL，与对照组间差异显。HC组和各制备物组CAT活力比生理盐水组活力增强。两组醇相导入制备物为血清中T-AOC能力最高的两组分别为10.23±2.10单位/mL 血清，10.15±1.65单位/mL血清。较HC组升高23.84%和22.88%。.综上，本试验中所得经Neutrase0.8L水解所得到的酪蛋白水解物经Plastein反应后，所得到的修饰产物具有良好的体外稳定性及体内降血压活性，其活性强于未经修饰的酪蛋白水解物。本研究还表明，酪蛋白水解物修饰产物体内降血压作用是通过内肾素-血管紧张素-醛固酮系统和氧化-抗氧化系统协同完成。