人类极体基因组在线粒体捐赠胞浆中的去甲基化与再甲基化特征

Polar body transfer mitochondrial donation could effectively block the transmit of genetic mitochondrial disease, but whether the demethylation/remethylation on polar body genome that should be abandoned can carry out normally in healthy cytoplasm have not been elucidated. Our previous study found that both mouse and human polar body shared same genenic and epigenetic background compared with its corresponding genetic material in cytoplasm. And we have obtained normally developed polar body transfer mitochondrial donated mice and polar body transfer mitochondrial donated human embryonic stem cells in previous study. Therefore, the project speculate that demethylation/remethylation on polar body genome could carry out normally in healthy cytoplasm. Based on this, the project intends to study on the mitochondrial donated reconstructed oocyte by maternal genetic material from human polar body, to explore whether the active and passive demethylation on female and male pronucleus could be carried out concertedly, analyze the dynamic of DNA methylation in early development of mitochondrial donated embryo, and tracing the epigenetic status of mitochondrial donated human embryonic stem cells, from zygote to hESCs, during the long time culture. To provide efficient security data for clinical transformation of polar body transfer mitochondrial donation.

极体移植线粒体捐赠可有效阻断线粒体遗传病的传递，但本应“废弃”的极体基因组能否在捐赠的健康线粒体胞浆正常去甲基化/再甲基化修饰尚未得到阐明。本课题组前期研究发现小鼠和人类的极体在遗传学与表观遗传学上均与其胞浆内对应遗传物质一致，并获得了发育正常的极体基因组移植线粒体捐赠小鼠、人极体移植线粒体捐赠胚胎干细胞系。因此，本项目推测极体基因组能在捐赠的健康线粒体胞浆中得到正常去甲基化/再甲基化修饰，基于此，本项目拟以极体基因组作为母源遗传物质构成线粒体捐赠重构卵，探索其受精后形成的雌原核能否与雄原核高度协调地进行主动与被动去甲基化，分析线粒体捐赠重构胚早期发育过程中DNA甲基化模式的变化，并追踪解析线粒体捐赠胚胎干细胞在长期传代过程表观遗传修饰的状态，即从受精、卵裂到干细胞水平全面地解析极体基因组在线粒体捐赠胞浆中表观遗传学重编程的动态变化，为极体移植线粒体捐赠技术的临床转化提供有效的安全性数据。

卵子发生过程中减数分裂产生的极体可以替代卵胞浆中核物质进行线粒体置换，从而有效减少甚至阻断致病线粒体DNA向子代传递。而极体作为自然界中本应被废弃的细胞，其基因组作为母源性遗传物质诞生子代是否是偶然事件？极体在体外培养过程中一直会保持基因组的完整吗？极体基因组移植到捐赠胞浆中能否经历正常的表观遗传学重编程从而完成正常的胚胎发育？本项目围绕人类极体移植线粒体置换的安全性进行研究，分析了人类卵子减数分裂产生第一极体过程中卵子与极体的细胞核与细胞质特征变化，为体外成熟卵子的第一极体进行极体移植或者极体活检胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的时间提供了数据支持。项目建立了基于数字PCR联合极体活检/囊胚活检的预防mtDNA遗传病PGD平台。同时，项目建立了高效的人极体基因组移植线粒体捐赠技术体系，获得的人PB1T与ST及ICSI的受精率、囊胚形成率、胚胎干细胞（hESCs）衍生率均无显著统计学差异。PB2T组的囊胚形成率、hESCs衍生率与PNT组及ICSI对照组亦无显著统计学差异。四种线粒体捐赠重构囊胚衍生的hESCs均为正常46XX/46XY核型。与常规ICSI来源的hESCs有相似的基因表达谱和DNA甲基化图谱以及体内外分化成三胚层细胞的能力。以上遗传学与表观遗传鉴定结果证实人类极体基因组能够在捐赠的卵胞浆中经历遗传与表观遗传学重编程从而完成正常的受精、卵裂、囊胚发育。线粒体DNA异质性分析发现四种线粒体捐赠技术均能有效减少核源性mtDNA的残留，但是ST、PNT所携带的mtDNA残留显著高于PB1T和PB2T，而PB1T有望彻底消除mtDNA残留。