橡胶树橡胶粒子膜定位HbHMGR1的磷酸化修饰与活性调节研究

Mevalonic acid (MVA) pathway is the main pathway of isoprenoid metabolism in plants. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMGR) is one of the key rate-limiting enzymes by regulating ‘carbon fluid’ into the pathway and its activity is mainly regulated by phosphorylation and dephosphorylation. The rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree is a typical isoprenoid metabolic pathway. Although the rubber particles in laticifer cells have been considered as an organelle that is closely related to the rubber biosynthesis, it is concluded that the enzymatic reactions from acetyl coenzyme A to geranylgeranylpyrophosphate occur in the cytosol. This concept is consultative. Recently, we confirmed that the highly expressed HbHMGR1 in laticifer cells was rubber particle membrane-located. Moreover, its gene expression was up-regulated by either tapping or jasmonic acid and changes in the level of phosphorylation of HbHMGR1 occurred upon tapping. Based on these findings, we suggest that the phosphorylated modification of HbHMGR1 may be a key point of rubber biosynthesis regulation. This project focuses on the phosphorylation modification of HbHMGR1 and identification of its interacted protein kinases and phosphatases to resolve the regulation of phosphorylation modification of HbHMGR1 on its activity and deepen our knowledge of rubber biosynthesis regulation in rubber tree.

甲瓦龙酸（MVA）途径是植物类异戊二烯代谢的主要途径，其中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是该途径的限速酶，调节“碳流”进入，而磷酸化修饰是HMGR活性调节的主要方式之一。橡胶树乳管细胞中的天然橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯代谢途径。虽然橡胶粒子被认为是乳管细胞中与天然橡胶生物合成密切相关的细胞器，但以往认为从乙酰辅酶A到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的酶促反应都发生在细胞质基质中，这种观点值得商榷。最近，我们证明乳管细胞中高丰度表达的HbHMGR1定位在橡胶粒子膜上，其基因表达受割胶和茉莉酸上调，且割胶可改变其磷酸化状态。据此，我们推测该酶的磷酸化修饰可能是橡胶生物合成调控的关键环节之一。本项目拟采用生物化学和分子生物学技术，通过分析磷酸化修饰对HbHMGR1活性的影响及鉴定与其相互作用的蛋白激酶和磷酸酶，解析磷酸化修饰对其活性调节机制，加深对橡胶生物合成调控机制的认识。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是甲瓦龙酸途径的关键限速酶，在调节“碳流”进入异戊二烯代谢中起到重要作用。磷酸化修饰是HMGR活性调节的主要方式之一。橡胶树树皮中的乳管组织进行旺盛的橡胶生物合成（一种典型的植物类异戊二烯代谢）。本项目采用比较磷酸化蛋白组技术和酵母双杂交文库筛选技术，对未开割树和开割树小橡胶粒子和胶乳进行系统性分析，主要研究成果如下：.1.比较磷酸化蛋白质组从HbHMGR1的N端检测到5个全新的磷酸化位点。通过对开割树和未开割树小橡胶粒子蛋白进行磷酸化蛋白质组分析，发现开割后分别有964个蛋白和1063个蛋白发生磷酸化和去磷酸化修饰。进一步分析发现大量的橡胶合途径关键酶在割胶处理时被磷酸化，并且在HbHMGR1的N端检测到5个全新的磷酸化位点，其中4个为其所特有。.2.HbHMGR1的磷酸化修饰调控不直接依赖于SnRK激酶和PP2A磷酸酶。从橡胶树基因组数据中鉴定到45个HbSnRK成员和37个HbPP2A成员，对包括SnRK1亚族和HbPP2A/B’’亚族在内的21个成员与HbHMGR1进行点对点酵母双杂交，结果显示这些成员与HbHMGR1均无互作关系，表明在橡胶树中HbHMGR1的磷酸化修饰调控不直接依赖于SnRK激酶和PP2A磷酸酶。.3.HbHMGR1之间及其与其他蛋白互作可能是其活性调节的一种方式。以HbHMGR1为诱饵，从未开割树胶乳文库中筛选到3种蛋白： SERF protein、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 1和HbHMGR1；从开割树胶乳文库中筛选到5种蛋白：NAC domain-containing protein 91、histone deacetylase HDT1、major latex allergen Hev b 5、transcription factor TCP21和Serine-threonine kinase receptor-associated protein。.通过本项目的执行，鉴定到HbHMGR1存在5个全新的磷酸化位点，其中4个为其特有；筛选到8个与HbHMGR1互作的蛋白，包括一个丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白。初步揭示了橡胶树橡胶粒子膜定位HbHMGR1的磷酸化修饰与活性调节模式，为深入认识天然橡胶合成调控机制奠定了良好的基础。