巴西橡胶树橡胶粒子膜蛋白复合物的研究

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞中的一种特殊的细胞器，是天然橡胶生物合成和储存的最终场所，其表面存在一些与橡胶生物合成直接相关的酶和蛋白质因子。Cornish K.等学者推测在橡胶粒子膜上可能存在由橡胶生物合成的关键酶-橡胶转移酶以及其它蛋白组成的蛋白复合物，对这些蛋白复合物的深入解析是揭示天然橡胶生物合成及其调控的分子机制的关键所在。在上一个基金项目的研究中我们首次发现橡胶粒子膜上存在多个蛋白复合物。在此基础上，本项目将采用蓝色温和聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE/SDS-PAGE）、Western杂交及质谱分析等方法对橡胶粒子表面的膜蛋白复合物进行分离、鉴定，结合生物信息学分析，深入了解橡胶粒子膜蛋白复合物的空间拓扑结构、功能、亚基组成、相互作用等综合信息，力求对橡胶粒子膜上橡胶生物合成的分子机理研究有新突破。研究结果亦将为橡胶树的遗传改良和提高天然橡胶的产量提供理论依据。

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞中的一种特殊的细胞器，它是天然橡胶生物合成和储存的最终场所。已经知道在橡胶粒子膜表面存在一些与橡胶生物合成直接相关的酶和蛋白质因子，最近有研究报道在橡胶粒子膜上还发现一些参与天然橡胶的直接前体异戊二烯焦磷酸酯(IPP)合成调控的酶类。为了揭示发生在橡胶粒子膜表面的天然橡胶生物合成及调控的分子机制，本项目首次采用蓝色温和聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE/SDS-PAGE）、Western杂交及质谱分析等方法对橡胶粒子表面的膜蛋白复合物进行分离、鉴定。本项目首先分别用纯化后REF、SRPP和HRT2的重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得了高效特异的REF、SRPP和HRT2三种抗体；其次，利用改良的差速离心法分离纯化橡胶树大、小橡胶粒子， 12000rpm的离心速度可以有效分离大橡胶粒子，而离心速度达到30000rpm以上可以分离得到纯度很高的小橡胶粒子。第三，通过比较不同浓度的各种去污剂对橡胶粒子膜蛋白复合物的洗脱结果，发现用1%Digitonin处理大橡胶粒子、0.1%Triton X-100和1% Digitonin处理的黄色体膜蛋白用于BN-PAGE分析效果较好。研究结果表明橡胶粒子膜上存在多个蛋白复合物，强信号蛋白带分布在分子量60kD至1000kD之间，有的蛋白复合物与膜结合紧密,有的则结合较松散。研究发现REF，HRT2可与其它蛋白联合成高分子量复合物，以及在橡胶粒子膜上存在26S蛋白酶复合物等。研究还发现REF和SRPP等蛋白在大小橡胶粒子膜蛋白中差异表达，可能与橡子的形成和发育机制有关。研究结果将为橡胶树的遗传改良和提高天然橡胶的产量提供理论依据。