FOXD1介导的p53乙酰化在温阳解毒方成分松果菊苷抑制肝癌细胞恶性表型中的机理研究

Primary hepatocellular carcinoma (HCC) is a kind of common malignant tumor. Many Chinese formulas have been found effective in clinical treatment, but it’s hard for them to be widely acknowledged because of the uncertain material basis and action mechanism. In our previous study, we found that the component echinacoside in Wenyang Jiedu (WYJD) formula from Jinghua Ye could significantly inhibit proliferation of HCC cells and the expressions of FOXD1 and TRIB1, and the expression of FOXD1 was significantly higher in tumor tissues than in non-tumor tissues using a few samples. Furthermore, we have proved that TRIB1 could influence malignant phenotypes of HCC cells and there were some relationships between TRIB1 and p53 in our published paper. Therefore, we propose the hypothesis that echinacoside may influence malignant phenotypes of HCC cells by regulating the expressions of FOXD1 and TRIB1 and the acetylation of p53. This research aims to explore the effect of echinacoside in HCC treatment and clarify the mechanisms of FOXD1 and its downstream signaling pathways regulating malignant phenotypes of HCC cells by gene interference, gene over-expression, luciferase reporter gene assay and chromatin immunoprecipitation assay in levels of cells, molecules, animals and clinic. This research will provide the experimental basis for WYJD formula in HCC treatment, and also contribute new targets for drug development.

原发性肝细胞癌（简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一。许多中药方剂在临床肝癌治疗中疗效显著，但由于有效物质基础和作用机理不明确，推广应用受限。前期研究发现，名中医叶景华经验方温阳解毒方成分松果菊苷显著抑制肝癌细胞的增殖以及FOXD1和TRIB1的表达，且小样本量的肝癌患者中发现FOXD1在癌组织中高表达；申请人已发表论文证实TRIB1与肝癌的恶性表型、p53表达存在相关性。由此我们提出假说，松果菊苷可能通过抑制FOXD1，下调TRIB1表达，从而介导p53乙酰化来调控肝癌细胞恶性表型。本项目拟通过细胞生物学、分子生物学、动物实验及临床样本分析等系统方法，运用基因干扰和过表达、荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀等技术，探讨松果菊苷在肝癌治疗中，通过FOXD1及其下游信号通路对肝癌恶性表型的调控机制。本项目将为验方温阳解毒方治疗肝癌的临床使用提供科学依据，也为肝癌治疗提供新的候选靶点。

本项目通过细胞生物学实验、分子生物学实验、动物实验等多种研究方法，运用基因干扰、基因过表达、荧光素酶报告基因等多种实验技术，开展温阳解毒方成分松果菊苷抑制肝癌细胞恶性表型的机理研究。阐明了温阳解毒方有效成分松果菊苷在肝癌治疗中的作用，以及 FOXD1 及其下游信号通路对肝癌恶性表型的调控机制。 .本项目结果说明松果菊苷显著抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力；还发现松果菊苷显著性促进miR-30c-5p的表达，抑制miR-30c-5p后可削弱松果菊苷对肝癌的抑制作用；通过生物信息学分析发现，miR-30c-5p是调控FOXD1的重要miRNAs之一，转染miR-30c-5p的mimics和inhibitor，并检测FOXD1的mRNA和蛋白水平，显示miR-30c-5p的mimics可显著抑制FOXD1的表达，而inhibitor呈相反趋势；过表达miR-30c-5p后可显著抑制荧光素酶的活性，inhibitor呈相反趋势，而突变质粒无明显变化；在转染miR-30c-5p的mimics细胞中，再转染外源性的FOXD1的过表达质粒，miR-30c-5p的mimics可显著抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力，过表达FOXD1可显著促进肝癌细胞的侵袭和迁移；随后在细胞中转染FOXD1干扰片段，干扰FOXD1可显著抑制细胞的侵袭和迁移。动物荷瘤实验结果表明松果菊苷促进miR-30c-5p的表达，而抑制FOXD1和KLF12的转录水平，同时在肺组织的转移灶减少，此外，过表达miR-30c-5p同样可以降低FOXD1和KLF12的转录水平以及转移灶的形成。TCGA数据库分析显示肝癌组织中miR-30c-5p显著低表达，而FOXD1和KLF12显著高表达，同时FOXD1和miR-30c-5p负相关，而FOXD1和KLF12呈正相关，具有统计学意义。.本项目验证了松果菊苷通过上调miR-30c-5p的表达，靶向识别FOXD1的3’UTR，抑制FOXD1的转录，从而降低其表达，FOXD1进一步抑制KLF12的表达，最终抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力，达到改善肝癌的发生发展的治疗效果。本项目的完成，将为验方温阳解毒方治疗肝癌的临床使用提供科学依据，为松果菊苷作为抗肝癌新药的研发提供实验依据，同时为肝癌的候选药靶研究提供新的理论依据。