FO通过MFAP5调节Jun信号通路抑制肝癌细胞恶性表型的机理研究

N-trans-feruloyloctopamine, FO, isolated from Garlic skin and belonging to the hydroxycinnamic acid amides family, was identified inhibiting tumor cell proliferation. However, the mechanism of FO in suppressing tumor malignant phenotype is still unknown. Our preliminary study showed that a novel signal, MFAP5, was downregulated after treated with FO in HCC cells. Though a study showed that MFAP5 could regulate Jun related signaling pathways in ovarian cancer cells, the roles of MFAP5 in HCC cells was scarce so far. We speculated that FO suppresses tumor cell malignant phenotype might be through Jun signaling pathway regulated by MFAP5 in HCC. In this study, the effect of FO on HCC cell malignant phenotype will be explored firstly using cellular function assay. Lentivirus mediated Mfap5-RNAi and recombinant Mfap5, as well as qPCR Array, were used to validate the effect and possible mechanisms of MFAP5 on HCC growth and development by in vitro cellular model and in vivo animal model. MFAP5 is upregulated in HCC cells after treated with FO, to pharmacologically explore the reciprocity between FO and MFAP5, further screening response genes related to FO. Finally, large clinical samples of patients with HCC are recruited to validate the effect of MFAP5 on prognosis. From the above, the mechanisms of FO regulating tumor cell malignant phenotype and the regulating pathways of MFAP5 will be addressed.

FO是从大蒜皮中分离出的肉桂酸酰胺类小分子化合物。研究发现其可抑制肿瘤细胞增殖，但其抑制肿瘤恶性表型的机理不清。我们初步研究发现，FO预处理，显著下调肝癌中新发现的信号分子MFAP5，抑制肝癌细胞增殖。文献发现MFAP5可调控卵巢癌细胞Jun相关信号通路。但在肝癌中的研究尚未见报道。我们推测：FO可能通过MFAP5调节Jun信号通路抑制肝癌细胞恶性表型。本课题拟利用细胞功能实验验证FO对肝癌恶性表型的影响；通过慢病毒介导的Mfap5沉默/过表达体系及qPCR Array技术，细胞及动物水平研究MFAP5在肝癌进程中的作用及下游相关调节机制；对FO干预后的肝癌细胞进行Mfap5过表达，研究该基因在FO抑制肝癌恶性表型中的作用，筛选下游应答基因；最后利用临床大样本肝癌病理标本，通过组织芯片验证MFAP5对肝癌患者预后的影响。揭示FO通过MFAP5调节Jun信号通路抑制肝癌恶性表型的分子机制。

FO是从大蒜皮中分离出的肉桂酸酰胺类小分子化合物。本项目旨在揭示FO作用于肝癌增殖的分子机制，寻找调节肝癌发生发展的关键靶点及后期靶向药物研发。首先对FO药物干预后的肝癌细胞进行基因表达谱芯片分析，对FO处理后表达下调的基因利用基因功能注释、生物信息学及对比PubMed数据库进行分析，发现FO对肝癌细胞的抑制功能主要富集在细胞生长，并筛选出Mfap5及Pcid2等15个显著下调基因，并分别进行慢病介导的shRNA基因沉默，发现Pcid2基因沉默可显著抑制肝癌细胞增殖。进一步细胞功能实验及体内外实验发现，PCID2在肝癌细胞及组织中的表达水平显著高于正常肝细胞及组织，且PCID2表达水平与肝癌患者总生存期差呈正相关。PCID2是调节肝癌增殖及细胞周期的关键分子。蛋白与小分子化合物结构分析发现，FO的三个羟基分别与PCID2蛋白的三个位点氨基酸及七个位点氨基酸有氢键及疏水相互作用，进一步细胞增殖回补实验发现，PCID2过表达可显著降低FO的药效，提示PCID2可能是FO的有效药靶。体外细胞功能实验发现，PCID2沉默可显著抑制肝癌Hep3B细胞、Bel-7402细胞、Bel-7404细胞及Huh7细胞的增殖能力；沉默PCID2表达水平对Hep3B及Huh7细胞克隆形成能力有显著抑制作用，并促进细胞凋亡，阻滞细胞周期至G0/G1期。体内裸鼠肝癌移植瘤实验发现，PCID2沉默组肿瘤生长速度明显减缓，PCID2沉默对肝肿瘤生长具有显著抑制作用。实验进一步开展了转录组与蛋白组学多组学联合分析，KEGG通路分析发现，PCID2分子的功能主要富集在细胞增殖过程中的胞嘧啶合成通路（hsa00240）。PCID2沉默后，该通路中DCTPP1及TYMS基因在转录水平和翻译水平均显著下调。双荧光互补分子互作（BiFC）实验发现，PCID2与TYMS及DCTPP1有直接相互作用。本项目研究结果发现：1）PCID2是调节肝癌生长的潜在新靶点；2）PCID2可通过TYMS及DCTPP1促进胞嘧啶异常代谢，增强肝癌细胞DNA合成能力，加速肿瘤细胞生长；3）PCID2可能是研究分子靶向药物的重要靶点，针对该靶点的后续验证及天然小分子药物的优化仍在继续开展。该研究结果发现了调节肝癌生长的新通路，并为靶点药物研发提供了新思路。