基于新型co-Neutron-Encoding技术对蛋白质精氨酸二甲基化修饰进行质谱精准鉴定研究

The arginine dimethylation is an important post-translational modification, which plays a role in regulation of the cellular processes, including signal transduction, apoptosis, etc. However, the analysis of dimethylarginine (MetR) in proteins by traditional proteomic approaches relies on data-dependent acquisition for tandem mass spectrometry (MS/MS), resulting in a large number of misidentifications. Herein, we propose to develop a novel co-neutron-encoding (coNeuCode) technique. By combination of targeted MS/MS, the approach enables sensitive and accurate characterization of the protein MetR sites in a large-scale manner. The project aims to: (1) design the stable isotope labeled amino acids for encoding of proteins in cell cultures to obtain site-specific labeling of MetRs; (2) develop an algorithm for screening of NeuCode signatures in mass spectra, and establish an efficient analytical pipeline for identification and quantification of protein MetR; (3) apply the coNeuCode technique for screening of substrates of protein arginine methyltransferases in cancer cells, and obtain the site map and regulatory network; (4) and, design and patent coNeuCode kits.

精氨酸二甲基化（MetR）是蛋白质的重要翻译后修饰，可调控信号转导、细胞凋亡等关键生理过程。然而，传统蛋白质组学方法利用数据依赖型方式采集二极谱数据，对低丰度MetR肽段造成大量漏检和误检。为提高检测的灵敏度和可信度，本项目拟开发新颖的co-Neutron-Encoding （coNeuCode）技术，并结合靶向串联质谱方法对蛋白质MetR进行大规模质谱表征。①标签研发：研发稳定同位素标记的coNeuCode氨基酸，实现细胞培养中MetR的位点专一性标记；②流程开发：开发用于 “特征谱”定位的计算机程序NeuCodeFinder，并优化分离、富集等关键技术节点，建立并评估质谱定性定量分析流程。③生物应用：应用coNeuCode技术对癌细胞中精氨酸甲基化转移酶的底物进行筛选鉴定，并绘制位点地图和调控网络。④试剂盒：构建具有自主知识产权的试剂盒。

蛋白质精氨酸甲基化是真核生物中一种广泛存在且相对保守的蛋白质翻译后修饰，参与多种重要的细胞生命过程，包括：RNA加工、DNA修复、转录调控、蛋白质核质穿梭、信号转导、细胞凋亡、染色质重塑等。在分子水平上对这些生物学过程的理解要求对甲基化蛋白进行全面表征。但目前只有少数的甲基化蛋白质和位点被确定。为实现精氨酸甲基化的规模化鉴定，本研究设计了coNeuCode标签，编写NeuCodeFinder软件，并建立了高效的DOMAIN分析方法，实现对甲基化酶PRMT3底物的筛选。优化质谱分析流程，并完成HILIC色谱对分馏精氨酸甲基化肽段的评估。在A549细胞中的甲基化肽段的大规模研究中，发现了311个新的甲基化位点，探析了甲基化和磷酸化修饰之间的串话关系。应用DOMAIN技术并结合SILAC技术，对精氨酸甲基转移酶PRMT3的底物进行了筛查。建立了基于肽组学技术的甲基化修饰大规模鉴定方法，对HeLa等7种人源细胞系的内源性肽的甲基化修饰进行了规模化鉴定。并对提取和富集方法均进行了优化，利用methyl-SILAC技术，在HeLa细胞中获得了高达83%的真阳性鉴定结果。在7种人源细胞的646个蛋白上共鉴定到700个甲基化修饰，其中61%为新甲基化位点。本研究开发的新技术具备很好的临床应用潜力，期望能为深入分析甲基化修饰在疾病和生物学中的功能提供有利的工具，有助于进一步揭示疾病的发生发展机制。