Rho激酶异构体诱导NF-κB活化参与酒精致肠黏膜屏障损伤及其与AQP8表 达的作用机制

In previous study, we observe alcohol-induced intestinal epithelial barrier dysfunction, and found that RhoA / ROCK-MLC regulatory pathways exist. The project will confirm ROCK expression in intestinal epithelial cells and the alter of the kinase isoforms activity in alcoholic liver damage model and use genetic engineering to build mutants ROCK1, ROCK2 system lentivirus infection, proved that two isoforms affect the activity of NF-κB differentially, and use NF-κB gene silencing lentiviral infection system proved the activity of NF-κB affect the expression of AQP8. And we confirmed the relationship between the ROCK kinase isoforms, NF-κB and intestinal barrier injure. And we will research ROCK kinase isoforms regulate activity of NF-κB and expression of AQP8, and clarify that activity of NF-κB regulated expression of AQP8 in alcohol-induced intestinal tissue edema, that was one of the important mechanisms of mucosal barrier injury. This study will find the initiating mechanism of alcohol-induced water metabolism disfunction and intestinal barrier damage, and provide a strong basis for the treatment of ALD disease.

我们既往研究在细胞学上观察酒精对肠上皮细胞屏障功能障碍中，RhoA/ROCK-MLC调控通路的存在。本项目将在前期研究的基础上论证在酒精性肝损伤模型中肠上皮细胞ROCK激酶异构体的表达和活性的改变，利用基因工程的方法构建ROCK1、ROCK2的突变体慢病毒感染体系，证明两种异构体对NF-κB活性的差异，并利用NF-κB基因沉默的慢病毒感染体系证实NF-κB活性对AQP8表达的影响。同时研究ROCK激酶异构体、NF-κB与肠粘膜屏障功能损伤之间的相互关系。且在此基础上研究ROCK激酶异构体调控NF-κB的活性，进而影响AQP8的表达是酒精诱导肠壁组织水肿、肠粘膜屏障损伤的重要机制之一。期望以此研究，探明酒精影响肠道组织的水代谢致屏障功能损伤的始动机制，为ALD疾病的治疗提供有力的依据。

我们既往研究在细胞学上以RhoA/ROCK为切入点，观察酒精对肠上皮细胞屏障功能障碍中，RhoA/ROCK-MLC调控通路的存在。NF-κB（核因子κB）作为ROCK（Rho相关蛋白激酶)的另一下游效应分子，在酒精致肠黏膜屏障功能障碍过程中，所发挥的作用，以及二者之间的相互关系，目前国内外对其研究与关注甚少。本项目在前期研究的基础上论证酒精致肠黏膜屏障损伤过程中ROCK激酶异构体的表达和活性的改变，并利用基因工程的方法构建ROCK1和ROCK2的突变体慢病毒感染体系，基因沉默该慢病毒感染体系。应用Caco-2细胞系建立肠粘膜屏障的体外实验模型，结果证实，Rho相关激酶（ROCKs）异构体，即ROCK1和ROCK2在酒精诱导的肠粘膜屏障功能障碍过程中发挥重要作用。酒精暴露会明显增加ROCK异构体的表达及NF-κB的活性。而ROCK1和ROCK2特异性的干扰和NF-κB抑制剂均可部分地抑制乙醇诱导的体外肠粘膜屏障模型中跨上皮细胞电阻值的升高。此外，下调ROCK1及ROCK2 mRNA和蛋白质的表达抑制了NF-κB的表达及活性，从而抑制水通道蛋白AQP8的表达。应用Wistar大鼠建立酒精性肝病的动物模型，我们发现，下调ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白质的表达抑制了乙醇诱导的NF-κB p65的核转移，从而抑制水通道蛋白AQP8表达的增加，部分地恢复了乙醇诱导的肠粘膜水肿，抑制在此过程中炎症因子的释放，进而减少肠粘膜的损伤。总而言之，该项目证实了ROCK激酶异构体、NF-κB与肠黏膜屏障功能损伤之间的相互关系。且在此基础上证实了ROCK激酶异构体可抑制NF-κB活性，进而影响AQP8的表达是酒精诱导肠壁组织水肿、肠黏膜屏障损伤的重要机制之一。证实了ROCK异构体为酒精影响肠道组织的水代谢，诱导肠粘膜的炎症反应，从而导致屏障功能损伤的始动机制，为酒精性肠粘膜损伤的治疗并阻止对肝脏的二次打击提供有力的依据。