FoxO4参与酒精诱导肠黏膜损伤机制的研究

The pathogenesis of intestinal mucosal barrier injury induced by alcohol is complex and the lack of effective therapy. Intestinal mucosal barrier dysfunction induced by Fox04 which is considered to be the main reason of the pathogenesis. Fox04 is upregulated by phosphatidylinositol 3 kinase / protein kinase B phosphorylation . In the absence of stimulation factors, FoxO4 is dephosphorylated state, and located in the nucleus; when the stimulus occurs, FoxO4 is phosphorylated and inactivated, makes the FoxO4 removed from the nucleus, FoxO4 transcription activity was inhibited. With the transcription factor FoxO4 phosphorylation and dephosphorylation, dissociation and combination with DNA, expression can close or start of its downstream genes. So we speculate:ethanol induced FoxO4 phosphorylation, leading to an increase in the transcriptional activity of NF-κ B is the main mechanism of intestinal mucosal barrier dysfunction. To confirm the hypothesis, we use gene mutation, gene silencing to prove the FoxO4 phosphorylation is the initial factor of ethanol induced intestinal mucosal barrier dysfunction. The successful implementation of this project for the prevention and treatment of alcoholic liver disease provide new therapeutic targets.

酒精诱导肠黏膜屏障损伤的发病机制复杂同时缺乏有效的治疗手段。Fox04诱导的肠黏膜屏障功能障碍被认为其发病的主要原因。Fox04上游受磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B磷酸化级联通路的调节。在无刺激因子存在时，FoxO4处于去磷酸化状态，位于核内;当刺激因素出现时，FoxO4被磷酸化而失活，使得FoxO4从核内移出，FoxO4转录活性受抑制。随着转录因子FoxO4的磷酸化及去磷酸化、同DNA的解离与结合，可以关闭或启动其下游某些基因的表达。于是我们推测：酒精诱导FoxO4磷酸化，从而导致NF-κB的转录活性增加是肠黏膜屏障功能障碍的主要机制。为证实假设，我们利用基因突变，基因沉默等来论证FoxO4磷酸化是酒精诱导肠黏膜屏障功能障碍的始动因素。本项目的成功实施为酒精性肝病的治疗与预防提供新的治疗靶点。

酒精诱导的的肠黏膜损伤是酒精性肝病重要的发病机制之一，而本项目的前期研究证实：FOXO4诱导的肠黏膜屏障功能障碍是酒精性肝病发病的主要原因，FOXO4上游受磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B磷酸化级联通路的调控。在无刺激因素存在时，FOXO4处于去磷酸化状态，位于细胞核内，当刺激因素存在时，FOXO4被磷酸化而失活。本项目按照计划成功完成了FOXO4、FOXO4-TB以及NF-κB慢病毒的构建，并且制备了相应感染的慢病毒颗粒，并完成相应的测序工作。体外实验部分:同时成功提取了小鼠肠黏膜的IECs并进行培养，成功构建了酒精诱导的肠黏膜屏障功能障碍的细胞模型，完成了对大鼠肠黏膜通透性的改变的相关检测，分别应用FOXO4、FOXO4-TB以及NF-κB慢病毒对酒精诱导的肠黏膜屏障功能障碍的细胞模型进行干预，同时应用Real-Time PCR、Western blotting等相关技术对FoxO4及NF-κB、Occludin、ZO-1等相关基因的表达情况进行了检测，分析FoxO4在细胞核内外的表达及其磷酸化水平的变化。体内实验部分:应用Lieber-Decarli流食喂养雄性C57BL/6J小鼠，成功构建了小鼠肠黏膜屏障功能障碍的动物模型，对小鼠肠道及肝脏的HE染色病理学检查，分别应用FOXO4、FOXO4-TB以及NF-κB慢病毒干预酒精性肝病动物模型后，同时应用Real-Time PCR、Western blotting等相关技术对FoxO4及NF-κB、Occludin、ZO-1等相关基因的表达情况进行了检测，明确了FoxO4在酒精诱导的肠黏膜屏障功能障碍中的作用。证实了酒精诱导的肠黏膜屏障功能障碍小鼠组织及酒精处理的IECs细胞制备的肠黏膜屏障功能障碍模型中的FoxO4的表达活性的变化，造模成功后，FOXO4的表达水平显著降低，而P-FOXO4的表达水平显著升高，明确了FoxO4及P-FoxO4与调控酒精诱导的肠黏膜屏障功能障碍密切相关。进一步证实了FoxO4通过P-FoxO4的表达水平来调控NF-κB的表达水平，从而改变了肠黏膜屏障功能的通透性，降低了肠道紧密连接蛋白Occludin、ZO-1等相关基因的表达水平，导致了肠黏膜屏障的发生，决定了疾病的转归。该研究成果能够为酒精性肝病的治疗提供理论与实验依据，为酒精性肝病的新药研发提供新的靶点。