亚硝酸钠对NADPH氧化酶介导的氧化应激调控机制的研究

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase and NADPH oxidase-dependent oxidative stress have been found to play important roles in the pathogenesis and development of various diseases. In our previous study, it was found that nitrite could effectively inhibit the activity of NADPH oxidase and attenuate NADPH oxidase-induced reactive oxygen species in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated neutrophils. Nitrite, therefore, may serve as a potential antioxidant and offer novel protection against oxidative stress and inflammatory disease. However, the precise molecular mechanisms are still unclear. Considering the intimate relationship among nitrite, nitric oxide (NO) and NADPH oxidase, and the fact that nitrite can be recycled in vivo to form NO, we hypothesized that nitrite could significantly influence NADPH oxidase-dependent oxidative stress through nitrite reduction to NO. To confirm this hypothesis, the selective inhibitors for enzymes, RNA interference and western blot will be used to investigate the effects of sodium nitrite (NaNO2)–NO pathway on NADPH oxidase and NADPH oxidase-dependent oxidative stress in LPS-stimulated macrophages, endothelial cells and mice. The implementation of this project will demonstrate the novel mechanism of nitrite–NO pathway in NADPH oxidase and oxidative stress, and consequently open a new window for the prevention and treatment of inflammatory disease.

NADPH氧化酶及其介导的氧化应激是引起多种疾病发生发展的重要原因之一。我们前期研究发现，在脂多糖(LPS)刺激的中性粒细胞中，亚硝酸盐(NO2-)能有效抑制NADPH氧化酶活性及其诱导的活性氧，因而成为氧化应激和炎症疾病潜在的抗氧化因素，但其影响机制尚未阐明。基于体内NO2-能被还原成一氧化氮(NO)的现象，结合NO2-、NO与NADPH氧化酶的密切关系，我们推测NO2-可通过生成NO来干预NADPH氧化酶及其介导的氧化应激。为证实这个假说，本项目拟通过LPS刺激的巨噬细胞、内皮细胞和小鼠炎症疾病模型，采用酶选择性抑制剂，结合RNA干扰、免疫印迹等技术，研究亚硝酸钠(NaNO2)→NO途径对NADPH氧化酶及其介导氧化应激的作用机制。本课题将从NO2-调节体内NO水平的角度，研究NO2-影响NADPH氧化酶和氧化应激的新机制，其结果可能为防治炎症疾病提供新思路。

本项目在细胞和动物疾病模型中研究了亚硝酸盐(nitrite)对NADPH氧化酶及其介导氧化应激的影响机制，探讨了硝酸盐(nitrate)→nitrite→NO途径对血管氧化应激和内皮功能障碍的影响。(1)NO对内皮细胞中NADPH氧化酶的调节机制。在内皮细胞中，NO能通过诱导抗氧化酶-血红素氧合酶(HO-1)的表达来抑制NADPH氧化酶催化产生的O2.-。NO对NADPH氧化酶活性的抑制作用会被HO-1抑制剂或HO-1基因沉默所消除，HO-1终产物胆红素会干扰p47phox的胞膜转位功能。(2)Nitrite通过生成NO来抑制中性粒细胞中NADPH氧化酶活性及其介导的氧化应激。在脂多糖(LPS)刺激的中性粒细胞中，nitrite会抑制NADPH氧化酶催化产生的O2.-以及相关的H2O2、ONOO-和OCl-。在存在NO清除剂或黄嘌呤氧化还原酶抑制剂时，nitrite对O2.-的抑制作用均消失，说明nitrite可被黄嘌呤氧化还原酶还原成NO，并且nitrite衍生的NO能抑制NADPH氧化酶活性。(3)NADPH氧化酶是nitrite在炎症小鼠血管氧化应激中发挥抗氧化作用的主要靶标。在炎症小鼠中，nitrite的摄入会显著减轻LPS诱导的血管氧化应激、内皮功能障碍和死亡率。并且NO清除剂或黄嘌呤氧化还原酶抑制剂均会消除nitrite的保护作用。在存在nitrite的情况下，没有观察到NADPH氧化酶抑制剂进一步的保护作用，表明NADPH氧化酶可能是nitrite的重要靶标。(4)Nitrate通过抑制NADPH氧化酶活性减弱糖尿病血管中的氧化应激和内皮功能障碍。饮用水中的nitrate在生物体内提供了nitrate→nitrite→NO途径，并抑制糖尿病小鼠的血管氧化应激、内皮功能障碍和代谢综合征。NO清除剂或黄嘌呤氧化还原酶抑制剂也会消除nitrate对糖尿病小鼠的有益作用，从而证明了nitrite→NO途径在nitrate生物转化中的重要作用。在高糖培养的血管内皮细胞中，NO通过抑制NADPH氧化酶活性减弱氧化应激和内皮功能障碍。本项目揭示了nitrate→nitrite→NO途径通过调节NADPH氧化酶活性来削弱氧化应激和内皮功能障碍的影响机制。对NADPH氧化酶的干预，是nitrate/nitrite/NO信号通路在氧化应激和疾病中发挥抗氧化作用的重要途径。