顽拗型种子超低温保藏过程中维持细胞膜完整性的研究

Cryopreservation is considered to be the only way to long-preserve recalcitrant seeds. Sustain membrane integrity of seeds or tissue are the key issue for the cryopreservation, however, the molecular mechanisms are still unclear. The consistant of lipid molecular of membrane are the main factor for the membrane integrity and our previous work have showed that regulated the membrane molecular consistant could improve the survival rate after crypreservation. In this project, we will use confocal, lipidomics and other molecular method to compare the difference when cryopreserved Castanea mollissima(recalcitrant seed), Camillia sinensis (intermediate seed) and Pisum sativum (orthodox) during various cryopreservation process. The results of this project will provide strong theory for cryopreservation recalcitrant species in the future.

顽拗型种子对脱水和低温敏感，超低温（液氮）保藏被认为是其长期保藏的唯一方法。维持细胞膜的完整性是种子或组织超低温保藏的关键问题，但其分子基础尚不清楚。膜脂分子组成是影响膜完整性的主要因素。前期发现通过调控膜分子组成能提高顽拗型种子的超低温保藏效果。本项目拟以板栗（顽拗型）、茶（中间型）和豌豆（正常型）为研究对象，比较对照、直接脱水、蔗糖处理、蔗糖加PVS2处理，以及液氮冻存后恢复培养过程，1）通过膜渗漏和激光共聚焦观察膜形态检测膜的完整性；2）用脂类组学检测上述三个代表物种在超低温不同处理过程中11类120种膜脂分子的变化；3）用生物信息学的方法分析膜脂分子变化样式及其与膜完整性的关联；4）克隆上述关联中所对应的膜脂代谢的关键酶基因，并检测其表达与膜完整性的关联；5）用酶抑制剂等调控膜脂分子变化并检测超低温保藏效果以验证上述关联。该研究为将来大量进行种质资源的超低温保藏提供坚实的理论基础。

超低温保藏是对顽拗型种子长期保藏的唯一方法，超低温保藏过程中的关键技术问题是避免胞内冰晶，这可以通过降低细胞含水量来实现。然而，脱水过程会对细胞产生胁迫，特别是在细胞膜水平。因此，维持细胞膜的完整性是种子或组织超低温保藏的关键问题，但其分子基础尚不清楚。目前，植物玻璃化溶液的超低温保存方法已经广泛应用于植物超低温保存中。该方法包括：渗透保护、植物玻璃化溶液脱水（plant vitrification solution, PVS）、快速冷却、快速解冻、稀释和复水以及离体种植恢复。然而，为什么植物玻璃化溶液方法可以成功保存多个物种，每一个保藏步骤对细胞膜的组成和完整性机理尚不清楚。本项目重点以顽拗型种子厚朴为研究对象，建立了一套高效的体细胞胚发生途径的超低温保存方案，并以此为对象，采用脂类组学分析方法，比较了12个不同超低温处理的差异。结果显示：渗透保护处理和稀释复水处理两个相对的过程，发生了磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌酸（PA）和磷脂酰甘油（PG）的头集团互换，进行细胞膜重塑。关键的PVS溶液处理后，总脂水平显著升高，为细胞将要经历的冷冻过程储备了大量脂类分子。本研究结果表明，膜脂重塑和预防脂类降解是PVS方法成功应用的关键，从膜脂分子的角度对PVS超低温方法的成功应用机理进行了详尽剖析，为发展保存其他濒临灭绝物种的的技术发展提供了坚实的理论基础。. 此外，我们以云南山茶为研究对象选用对膜完整性有影响的试剂（N-酰基乙醇胺（NAE），正丁醇等）处理后，运用脂类组学测序手段，初步探索了不同处理后进行超低温保藏所导致的不同的成活率的原因，发现NAE处理有可能是通过抑制PLDα的酶活，从而减少了PA的生成，也降低了DAG的积累，从而有效地提高了超低温保藏后的成活率。该技术也有望运用到将来对多物种得超低温保藏体系中，以提高物种超低温保藏后的成活率。