N-酰基乙醇胺调控磷脂酶Dα1介导磷脂酸对种子储藏行为影响及机制研究

Three different types of seed storage behavior are recognized: orthodox (desiccation tolerance), recalcitrant (desiccation sensitive) and intermediate seeds (between those two). Desiccation results in membrane damage and induces membrane lipid changes, however, the correlation between the desiccation-induced membrane lipid change and seed storage behavior remains unclear. Our pilot experiment on the deisccation tolerance of seven species with different seed storage behaviors has been examined. The results indicated that PA as the marker of membrane damage increased dramatically in recalcitrant seeds during seeds drying, while did not change in orthodox seeds. Therefore, we hypothesized that PA formation might contribute to different seed storage behavior, and the desiccation tolerance of seeds might be influrenced by regulating of PA formation. This hypothesis will be examined and veryfied through current studies with the following methods: 1. Using lipidomics to analysis the PA content between PLDα1 mutants and wild type seeds of Arabidopsis, to prove that PA mainly come from hydrolysis of PLDα1 during seeds desiccation 2) Regulate PLDα1 through adding PLDα1 specific inhibition N-acylethanolamines, (NAE) or using PLDα1 mutants to verify whether those methords improve seed desiccation tolerance. 3) Examine the change of endogenesis NAE, the PLDα1 activity and PA content during desiccation. We expect that this study could help to uncover the correlation between desiccation-induced membrane changes, and to increase the knowledge for the long term storage of recalcitrant seeds in the future.

种子储藏行为分为正常型（耐受脱水）、顽拗型（脱水敏感）和中间型。细胞脱水导致膜伤害并诱导膜脂变化，但此现象与种子储藏行为之间是否存在联系及如何联系，尚无系统研究。我们前期对7个物种的脱水研究发现，膜伤害标志物磷脂酸（PA）在顽拗型种子中升高、在正常型种子中不变，由此提出假说：PA的产生有可能是导致种子不同储藏行为的原因，调控PA会影响种子脱水耐性。本项目拟：1）运用脂类组学手段，检测拟南芥野生型和磷脂酶Dα1（PLDα1）突变体种子在脱水过程中PA的含量，验证PA的产生主要来源于PLDα1的水解；2）通过外源施加PLDα1特异性抑制剂N-酰基乙醇胺（NAE）或基因表达缺失来调控PLDα1，检测种子的脱水耐受性是否受到影响；3）检测脱水过程中内源NAE变化样式，以及相对应的PLDα1活性和PA水平，验证上述假说，阐明种子脱水过程中膜伤害的机制，为保藏顽拗型种子提供新思路。

保存种子是植物种质资源长期保存的重要手段，然而，有7-25%的植物（在热带雨林中有高达47%的植物）产生的种子由于不耐脱水，无法通过常规的种子库保存技术进行保存，严重制约了国家的植物种质资源战略储备。虽然有很多研究表明这一现象与细胞膜功能的重要改变密切相关，但是其分子机制却没有深入研究。本项目前期研究发现，种子的活力的下降与磷脂酸（phosphatidic acid, PA）的上升密切相关。在本项目拟通过模式植物拟南芥野生型和突变种为研究对象，在亚细胞及细胞水平上深入挖掘膜脂分子改变与种子脱水耐受性的关系。首先我们通过干湿循环的模型（该模型利用种子在吸涨萌动过程中，从脱水耐受型转变为脱水敏感型这一特征），在亚细胞水平发现PLDα1蛋白在干燥过程中增加，并且从细胞质向细胞膜上移动，而PLD家族的另外一个重要成员，在此过程中却没有改变，由此证实干燥所诱导产生的PA是从PLDα1水解而来的。而且当PLDα1被抑制后，经过同样循环的种子萌发率显著增加。之后验证了PLDα1所介导PA的产生，调控了脱水敏感性种子的耐受脱水程度，当外源施加PLDα1的抑制剂显著性提高了脱水后种子的萌发率，同时在PLDα1缺失的突变体里，其耐受干燥压力的能力显著性高于野生型。本项目的研究结果，不仅发现种子的脱水耐受性与PA密切相关，而且运用实验数据阐述了PLD是如何通过调控PA来响应脱水过程。通过本项目研究结果，提出了一个全新的基于膜脂的关于种子脱水耐脱水能力的模型。并且提供了一种特殊的技术手段，可以通过外源施加PA产生的抑制剂，从而改变种子的脱水耐受性。本项目的研究结果不仅为将来延长顽拗型种子的寿命提供了科学依据，同时也有很好的应用前景。根据本项目研究成果所撰写的论文，已被国际植物学领域排名前5%的期刊接收。