基于遗传信息流从免疫相关基因研究右归丸干预老龄肾阳虚证的分子调控机制

前两项自然基金发现老龄肾阳虚证差异基因表达谱集中于免疫相关基因，而DNA甲基化与miRNA是调控mRNA差异表达的主要机制，从方、证、效相应提出"免疫相关DNA甲基化修饰与miRNA调控是老龄肾阳虚证发生与中药干预的的疗效机制之一"的假说。拟采集老龄肾阳虚证（服右归丸治疗前、后）与健康者三组全血，以前基因表达谱免疫相关基因为候选基因，沿"DNA→RNA→蛋白"的遗传信息流，开展DNA甲基化(MS-HRM)、miRNA(microRNA芯片)、mRNA（定量PCR）、蛋白（Western杂交）多层次研究，采用Co-Expression Network算法等对数据进行生物信息融合，揭示右归丸干预老龄肾阳虚的调控靶点和分子路径。研究开创了从中医证的角度挖掘基因功能的新篇章，为肾藏象理论内涵提供新的科学依据，对建立有特色的中医药疗效评价体系提供新思路，也是肾阳虚防治与养生保健的重要参考。

课题组提出“免疫相关DNA的甲基化、去甲基化是老龄肾阳虚证发生的机制之一”、 “免疫相关DNA的甲基化、去甲基化，也是中药干预老龄肾阳虚证的疗效机制之一”两点假说，根据前期课题研究结果，筛选了28条免疫相关基因，通过SYBR Green荧光定量PCR实验观测老龄肾阳虚经右归丸干预前后的基因表达水平差异，结果显示NCOA2具有统计学意义的显著差异；有6条基因（FHIT,COL13A1,IRAK2,SSTR5,TIAM2,PTGER1）存在差异表达，研究结果初步论证免疫类基因是右归丸干预肾阳虚的重要靶向之一。.对老龄肾阳虚体质采用右归丸干预，并进行治疗前后肾阳虚辨证因子的半定量化评分，证明右归丸具有良好的改善肾阳虚症状的疗效。采用Agilent Human miRNA (8*60K) V21.0芯片检测老龄肾阳虚经右归丸干预前、后和健康者的miRNA表达水平的差异。结果显示肾阳虚者与健康者的差异表达miRNAs集中在多种肿瘤、生殖疾病、骨生成、心血管疾病、阿尔兹海默病等老年多发慢性疾病方面，与中医肾主生殖、肾主髓通脑、肾在体为骨等生理功能衰老密切相关；结合肾阳虚治疗后和健康对照组间差异表达的miRNA与阳虚组和健康对照组的差异表达miRNA有33条存在重复，而肾阳虚者右归丸治疗前后的差异表达的miRNA仅删选出 6条，提示右归丸能改善肾阳虚症状，但对肾阳虚体质的改变确需更长时间，这也符合中医对体质具有相对稳定性的认识。最后根据差异表达miRNA在治疗前后表达量改变的趋势、结合中医肾阳虚衰的表现和Pubmed中文献对基因已知功能的报道，再次对6条miRNA进行SYBR Green荧光定量PCR验证，筛选认为miR-602可能是右归丸干预肾阳虚的重要靶点之一。.通过差异miRNA进行靶基因预测，结合之前的28条与免疫相关差异表达基因，确定了10条基因为目的基因，进行DNA甲基化水平的检测和SYBR Green荧光定量PCR验证，结果从基因表达水平的趋势上看，DICER1、NF1、SSTR5、FLT1表达均值逐渐向正常组靠近，从基因甲基化水平上看，DICER1、NPAS3、BMP7、SSTR5在右归丸干预后，甲基化的水平均发生增强或减弱，提示右归丸对这些甲基化水平的调节是干预老龄肾阳虚证的疗效机制之一。