NAC基因调控柽柳耐盐分子机理研究

NAC is a transcription factor family specific to plants, which is involved in plant development, defence and signal transduction; therefore, it plays an important role in stress tolerance of plants. Based on the fundation of cloning of 2 NAC genes from Tamarix hispida, these two NAC genes will be studied on three levels, namely: the upstrem regulators and signal transduction pathway, transcriptional regulation and activation, and the down-stream target genes. The promoter of NAC genes is cloned firstly,and the cis-elements involved in stress responsive will be identified by analyzing the activities of serial deletion mutants of promoters. Based on the identified cis-elements, yeast one hybrid is employed for investigation of the upstream regulators and signal transdcution pathway of NAC genes. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and EMSA is employed in studying the motifs binded by NAC. The partner of NAC genes is investigated by using Co-Immunoprecipitation. The NAC genes are transformed into T. hispida generating the overexpression and inhibit expression transgenic T. hispida. The transcriptoms of these transgenic and WT T. hispida are bulit using the high throughput sequencing method. The target genes of NAC will be determined by comparising the differentially expressed genes between overexpression and inhibit expression of transgenic T. hispida plants. These results may be contributed in revealing the molecular mechnism of salt stress tolerance, and provide the theoretical and practical base for molecular breeding of trees.

NNAC为植物特有的转录调控因子，参与了植物生长发育，多种防御反应及信号传导等多种重要生理过程，在植物抗逆过程中起重要作用。本项目在鉴定了两条有强耐盐能力的柽柳NAC基因的基础上，对它们进行三个层次的研究，即：其上游调控因子和信号通路、NAC的转录调控、其所调控的下游靶基因，系统揭示其响应高盐胁迫的分子机理。分离NAC启动子，通过构建启动子系列缺失载体来鉴定响应逆境胁迫的顺式元件，以这些元件为基础，利用酵母单杂交鉴定NAC上游调控因子。利用染色质免疫共沉（CHIP）、EMSA等技术研究NAC识别的motif，用免疫共沉淀研究其互作的蛋白。将NAC基因转入柽柳中，使之过表达和抑制表达，并利用高通量测序技术，建立它们的转录组，通过比较NAC过表达、抑制表达柽柳间的基因表达差异，研究NAC所调控的下游靶基因。进而阐明NAC基因调控柽柳耐盐的分子机理，进而为林木抗性分子育种提供依据。

NAC为植物特有的转录调控因子，在植物抗逆过程中起重要调控作用。本项目鉴定了2个调控柽柳耐盐的NAC基因(ThNAC1和 ThNAC13)，并对其抗逆的调控机理进行了系统研究。此外，根据评审专家建议，同时也对1个拟南芥的NAC基因(ANAC069)在抗逆过程中的作用进行了深入研究。主要研究内容包括NAC基因上游的调控因子鉴定，NAC所识别的顺式作用元件，以及NAC所调控的下游基因及这些基因所参与的抗逆生理途径分析。通过这些研究阐明NAC通过结合哪些顺式作用元件来调控基因，进而影响相关的生理学途径，最终来调控植物的耐盐能力。研究中，首先鉴定了柽柳NAC家族基因，然后研究了这些NAC基因对盐、旱及ABA等胁迫的响应等情况，鉴定出了逆境胁迫应答的NAC基因。对所研究的3个NAC蛋白进行转录激活研究，并确定了它们的转录激活域。分离了NAC基因的启动子，并鉴定了NAC的上游调控基因。所研究的NAC蛋白都能够结合NACRS元件。此外，我们还鉴定了ThNAC13和ANAC069转录因子结合的新元件，包括LTRE (“CCGAC”)、MYBcore(“AACGG”)及“C[A/G]GG[T/G]”序列等，它们在NAC调控的基因表达过程中起重要作用。研究了NAC所调控的下游基因及调控的相关的耐盐生理学机制。发现柽柳的ThNAC1和ThNAC13基因主要通过提高活性氧清除能力，提高脯氨酸和可溶性糖的含量，以及调控海藻糖的合成等方式来提高植物的抗逆能力。本研究阐述了NAC调控植物耐盐的生理及分子生物学机制，还鉴定获得了耐盐、抗旱能力优良的柽柳NAC基因，从而为林木抗性分子育种提供了优良的候选基因和理论基础。本项目研究共发表英文论文6篇，其中，SCI论文5篇，总影响因子20.1(按2015年IF计算)。已经按计划任务书完成了全部研究任务，但研究仍在深入，目前已投稿或在准备中的论文3篇，预期这些论文将在2018年底前完成发表。申请专利1件，培养博士、硕士研究生4名，其中，已毕业博士2名，1名博士获得东北林业大学优秀博士论文。