柽柳液泡膜H+-ATPase c亚基基因耐盐胁迫机理研究

V-ATPase在植物耐盐过程中起重要作用，是亚基构成最复杂的质子泵，其c 亚基参与了质子通道的形成，并负责质子的转运，是其关键亚基之一。我们已经从柽柳中克隆出了液泡膜H+-ATPase c亚基基因（ThVHAc1），研究发现其具有抗旱、耐盐及抗重金属胁迫等能力。在此基础上，本课题拟克隆出柽柳ThVHAc1基因的启动子序列，鉴定其启动子中的重要顺式作用元件，然后通过酵母单杂交等技术研究其上游的调控基因。将启动子与GUS基因融合，转入拟南芥，研究该基因在盐胁迫下的时空表达。将ThVHAc1基因转入杨树中，通过与野生型植株进行比较，研究H+-ATPase c亚基在生理及分子水平调控植物耐盐的机理。并进一步研究H+-ATPase c亚基的蛋白表达量与H+-ATPase活性的关系。通过以上研究来阐明ThVHAc1基因的耐盐机制。

V-ATPase 在植物抗逆过程中起重要作用，其c亚基参与质子通道的形成，并负责质子的转运，是其关键亚基之一。以往研究已证实柽柳ThVHAc1能提高转基因酵母抗旱、耐盐及抗重金属胁迫的能力。在此基础上，本课题进一步对ThVHAc1基因的耐盐和抗重金属胁迫功能及可能的机制进行了研究。. 克隆获得1164 bp柽柳ThVHAc1基因启动子序列，序列分析表明，该启动子区包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件。将ThVHAc1 基因启动子驱动GUS基因表达。对转基因Pro ThVHAc1::GUS拟南芥的GUS染色，结果显示除新鲜荚果和未成熟种子外，其他各时期及各部位几乎均能被GUS 染色。. 酵母单杂交发现，ThWRKY7基因能够特异性地识别ThVHAc1基因启动子上的元件。qRT-PCR证明，ThWRKY7与ThVHAc1基因在不同胁迫下具有相似的表达模式，进一步证明了ThWRKY7可能能调控ThVHAc1基因的表达。. 将ThVHAc1基因转入杨树中，获得转基因杨树。与野生型杨树相比，转基因杨树明显提高了耐盐能力。对两种杨树盐胁迫下一些抗逆相关生理指标分析结果表明，过表达ThVHAc1基因杨树盐胁迫下Na+/H+转运活性；一些保护酶活性、持水能力、生物量及叶绿素含量明显高于野生型杨树。活性氧含量和细胞受损伤程度降低。. 将ThVHAc1基因转入拟南芥中，分析比较了过表达ThVHAc1基因对拟南芥抗CdCl2胁迫能力的影响。结果表明，正常生长条件下转ThVHAc1基因拟南芥和野生型拟南芥的发芽、鲜重和主根长度没有明显差异，但CdCl2胁迫条件下，转ThVHAc1基因株系的发芽率、鲜重和根长明显高于野生型(P<0.05)。表明ThVHAc1基因能提高拟南芥的抗CdCl2胁迫能力。酶活性测定和ROS染色结果显示，CdCl2胁迫下，转ThVHAc1基因拟南芥提高了保护酶活性，从而减少了细胞中活性氧含量，使细胞损伤程度减轻。对过表达ThVHAc1基因拟南芥V-ATPase其他亚基的表达分析表明ThVHAc1基因的表达对其他各亚基的表达也产生了明显改变。. 此外，柽柳在盐和重金属胁迫后，ThVHAc1蛋白表达量明显提高，相应的V-ATPase全酶活性也提高，表明ThVHAc1基因的表达增加可能能影响V-ATPase其他亚基的表达，从而增加全酶活性。