基于患者特异性iPSCs分化的血管平滑肌细胞研究胸主动脉瘤TGF-β信号失衡机制

Thoracic aortic aneurysms (TAAs) is a life-threatening disease with strong hereditary. The precise mechanisms of TGF-β signaling dysregulation in Thoracic aortic aneurysm (TAA) is largely unknown. Based on our established platforms about the induced pluripotent stem cells (iPSCs) reprogramming and vascular smooth muscle cells (VSMCs) differentiation, in this proposal, we will generate TAA patient-specific iPSCs by episomal-vector mediated reprogramming and differentiate them into VSMCs through cardiovascular progenitor cells; Phosphorylation of SMAD and MAPK was detected by immunoblotting to check the activation of downstream pathways of TGF-β; Proliferation of VSMCs and TGF-β secretion were checked by MMT assay and ELISA; We will also use inhibitors, gene over-expression, CRISPR/Cas9 knockout, RNA sequencing and TAA animal model to manipulate the key components of TGF-β signaling and check VSMCs’ function responses, TAA progress and the underlying molecular mechanisms, to further proof our hypothesis: TGF-β signaling maintain the normal function of VSMC, Inhibition of SMAD-dependent canonical pathway and up-regulation of noncanonical MAPK pathway of TGF-β signaling led to dysfunction of VSMCs, consequently, contributed to TAA pathogenesis. This proposal will clarified the precise role of TGF-β signaling imbalance in dysfunction of VSMCs in human TAA pathogenesis, which will provide a fundamental theory for TAA therapeutic targeting on TGF-β noncanonical MAPK pathway in VSMCs.

胸主动脉瘤（TAA）具有很强的遗传性，TGF-β信号通路失调在其发病中的确切机制尚未阐明。在前期建立诱导多能干细胞（iPSC）重编程及血管平滑肌细胞（VSMCs）定向分化平台的基础上，本项目拟通过构建TAA患者特异性iPSCs（TAA-iPSCs)，并经心血管前体细胞分化为VSMCs建立疾病细胞模型；应用免疫印迹检测SMAD、MAPK等磷酸化以观察TGF-β下游通路激活情况，MTT，ELISA等测定VSMCs增殖，TGF-β分泌等功能变化；通过特异阻断剂，基因过表达，CRISPR/Cas9敲除，RNA测序及动物模型等，证明TGF-β信号经典SMAD通路抑制及非经典MAPK通路上调导致的失衡，促进VSMCs过度增殖及相关蛋白合成异常，最终促进TAA的进展。本研究对阐明TGF-β信号失衡在人TAA发病中的确切机制，发展针对TGF-β非经典MAPK通路为靶点治疗TAA策略提供科学依据和新思路。

胸主动脉瘤（Thoracic aortic aneurysm, TAA）是指胸主动脉壁局部的病理性扩张，超过正常血管直径的50% 时形成的血管病变，目前除了手术外,缺乏有效的药物治疗手段，因此探索TAA发病机制对于临床TAA的预防和治疗具有重要意义。 TAA具有很强的遗传性，TGF-β信号通路失调在其发病中发挥重要作用但其确切机制尚未阐明。本项目的研究显示，我们可以通过分离患者手术丢弃的主动脉血管组织获得原代细胞，经重编程后获得患者特异的诱导多能干细胞（iPSC），这些细胞表达多能干细胞的特异标志物，并具有在体内、外分化为三胚层的潜能。应用TAA患者特异的iPSC, 我们进一步通过多种方法定向诱导分化为血管平滑肌细胞（VSMCs），建立了人TAA疾病VSMCs细胞体外模型。应用此模型，我们进一步探索了TAA发病的细胞分子机制。应用免疫印迹及功能检测，我们发现TAA患者iPSC来源的SMC收缩功能减弱，收缩相关蛋白表达降低；增殖能力明显增强；TGF-β经典SMAD通路抑制、非经典ERK信号通路激活；此外，还发现其中一个患者存在COL4A2和COL6A2突变，并影响VSMC胶原的合成分泌，这些可能最终促进TAA的进展。总之，本研究揭示患者iPSC及定向分化的VSMC体外模型可应用与TAA疾病模型的研究，阐明TGF-β信号失衡在人TAA发病中的确切机制，可能为发展针对TGF-β非经典MAPK通路为靶点治疗TAA策略提供科学依据和新思路。