9-S/Se取代派洛宁染料：新的合成策略及其在检测HClO方面的应用

Derivatization of pyronin dyes in their 9th position is of great significance in expanding their actual applications. However, own to the current drawbacks in synthesis method (complex routes and low yields), they cannot be further used in related researches. To this end, we present here the rational design and synthesis route of such dyes. On this basis, we constructed a series of 9-S/Se substituted pyronin dyes for highly sensitive and selective detection of HClO. Moreover, through combining this fluorescent analysis method and confocal microscopy imaging technologies together, we can realize the detection and monitoring of HClO concentrations at the cellular and subcellular level in a “real time, dynamic, visual imaging” manner. Therefore, this research may provide reliable supporting date for us to further understand and evaluate of the basic role of ROS in tumor progression and apoptosis (such as signal transduction). We hope that this novel ideas and synthesis approach may stimulate and expand new research in this rapidly expanding multidisciplinary field.

9位取代派洛宁是一类性能优异的荧光团。然而，受制于当前合成方法的制约（步骤复杂及收率低），其相关的应用研究无法进一步深入。针对这一问题，本项目提出一种9位杂原子取代派洛宁衍生物的新的合成策略，突破目前合成方法的瓶颈。在此基础上，合理设计并制备9-S\Se取代的派洛宁衍生物作为荧光探针，实现对次氯酸（HClO）高灵敏性、高选择性以及可逆的检测；并将此荧光探针与激光共聚焦显微成像技术相结合，实现在细胞水平以及亚细胞水平上对HClO的实时、动态、可视化成像。为进一步分析研究HClO在肿瘤发生发展以及凋亡过程中的作用机理（如信号转导等热点问题）提供依据。通过本项目的实施，期望能拓展派洛宁类衍生物合成及应用的新思路及新方法。

通过本项目四年的详细系统的研究，我们提出了一种基于高效合成9-位派洛宁染料的方法，筛选出了2种用于HClO和GSH检测的荧光探针，并进行了细胞成像方面的应用，已达到预期的研究目标。主要内容如下：.1..利用单线态卡宾的亲核取代反应，以派洛宁为起始物，一步法制备9-位芳基取代派洛宁染料，成功得到了目标化合物PY-NBD。对反应条件进行了系统的优化和探索，确定最优的合成条件为（反应时间为12 h；温度为65 ℃；溶剂为THF；反应物比例为Pyronin Y : t-BuOK : NBD-Cl = 1 : 2 : 2）。与文献已报道的合成方法相比，该方法操作简单（由之前5步反应变为1步反应）；大幅度减少了反应时间（由原来的5天减少为12小时）；并且避免了剧毒试剂氰化钾及易燃试剂丁基锂的使用，降低了反应的危险系数。在派洛宁硫酮的基础上合成了相应的派洛宁S代、N代衍生物。派洛宁硫酮分别与卤代烃和胺类化合物反应，改变反应条件（如溶剂、温度等），成功的制备了一系列9-杂原子取代派洛宁衍生物；.2..利用紫外及荧光光谱对PY-TP 和PY-NBD的发光性能进行了研究。PY-TP 可以特异性的检测HClO含量的变化。PY-NBD与GSH等还原型化合物反应后，PY-NBD中的硝基被还原成胺基，导致分子处于激发态时TICT效应被阻断，从而恢复红色荧光发射。PY-NBD的最大吸收分别位于545 nm及575 nm处。当以575 nm激发时，其位于610 nm处的荧光发射被明显猝灭；当以545 nm激发时，该化合物发出强烈的黄绿色荧光，最大发射波长位于575 nm处。荧光猝灭的原因为TICT效应所导致。通过在B3LYP/6-31G(d)水平下有关激发能E(eV)、振子强度f以及相应的电子组态的理论计算得到进一步证实。.3..PY-NBD染料表现出良好的细胞通透性，1 μM PY-NBD便可以很好地对细胞染色。MTT法检测细胞毒性实验中表明该化合物在1 μM时几乎没有细胞毒性，也进一步说明，该化合物具有活体成像的可能。线粒体共定位实验表明，与市售的线粒体定位剂Rhodamine 123以及Deep Red对比，PY-NBD的皮尔逊系数达到0.95，说明PY-NBD可以作为线粒体定位剂。