卵巢组织内源性肽PFAP1促进原始卵泡激活的作用与机制研究

PFAP1 is an endogenous peptide identified by peptidomic techniques which is enriched in normal ovarian cortex and without any function report. Our previous study found that PFAP1 can promote the activation of primordial follicles. Bioinformatic and pull-down assay indicated that p27 is the probable target of PFAP1. As one of the important regulator of primordial follicle activation, p27 knockout can result in premature ovarian failure which hint that PFAP1 functions through p27. Our study will further analyze the follicle development, the oocyte maturation and blastosphere formation of the PFAP1 activated follicles and systematically demonstrate the function and mechanism of PFAP1 in promoting the primordial follicle activation of the old mice. Finally, our results will deeply evaluate the possibility and feasibility of the application of PFAP1 for promoting the residual primordial follicle activation and development of the Premature Ovarian Failure (POF) patients and people in peri-menopausal period. If successful, our study may provide a new strategy for the treatment of the POF patients and the people in the peri-menopausal period who have reproductive requirements and also provides new idea for the research of assisted reproduction.

PFAP1是我们借助多肽组学手段筛选获得的、在正常卵巢皮质组织丰度较高、功能未知的内源性多肽。前期研究发现，PFAP1具有促进小鼠原始卵泡激活的作用，进一步Pull-down等实验发现，p27可能是其结合靶标，而p27作为早期卵泡激活重要的调控因子，敲除后可以导致小鼠卵巢早衰的发生，提示PFAP1可能通过调控p27发挥其生物学功能。本研究拟进一步分析PFAP1促激活的原始卵泡的发育能力、卵子成熟能力和囊胚形成能力等指标，验证PFAP1在促进老年小鼠原始卵泡激活和发育中的作用等，从而深入评估PFAP1用于激活卵巢早衰（POF）病人及围绝经期妇女残余原始卵泡，促进其发育成熟的可能性与可行性。研究如获成功，有望为有生育要求的POF病人及围绝经期妇女提供新的治疗手段，并为辅助生殖研究提供新的思路。

卵巢早衰（Premature ovarian failure, POF）是由于卵巢内原始卵泡（primordial follicles, PFs）耗竭或功能异常而引起的卵巢功能障碍。POF严重影响患者的生殖健康，最终可导致不孕症。借助质谱技术，我们筛选了POF患者来源的卵巢皮质组织及正常卵巢皮质组织中差异表达的多肽。以ddH2O为对照，在POF患者卵巢皮质组织中发现4条明显下调的多肽。我们建立了新生3天（3 day postpartum, 3 dpp）ICR小鼠卵巢组织培养模型，用4种多肽溶液分别处理卵巢组织，以确定多肽对卵泡发育的影响。通过组织切片染色观察各级卵泡发育情况并对各级卵泡比例进行统计以及RT-qPCR检测卵泡发育相关基因如Gdf9、Bmp15、Amhr、Zp3及Cyclin A2、Cdk2等表达，评价其促进PFs激活的作用。我们鉴定到一条来自于Histone H4蛋白的含有14个氨基酸的多肽，命名为PFAP1（Primordial follicle activation peptide 1）。将PFAP1原位注射到老龄小鼠卵巢囊内，观察其对卵泡发育的影响。小鼠在体实验验证了PFAP1一定程度上能够逆转年龄相关的生育功能损伤，促进雌激素E2及抗苗勒管激素AMH的产生，降低卵泡刺激素FSH水平。通过多肽pull down和Western blot等实验探索PFAP1激活PFs的机制。在新生小鼠卵巢中，PFAP1可与微小染色体维持蛋白5（Minichromosome maintenance protein 5, MCM5）结合，抑制其泛素化，稳定蛋白水平。此外，PFAP1可能通过调节MCM5的功能促进原代小鼠卵巢GCs的增殖。我们的研究提示PFAP1通过调节MCM5的功能，促进新生小鼠卵巢中PFs的激活，一定程度上恢复老龄小鼠卵巢功能，促进原代小鼠卵巢GCs的增殖。新型多肽PFAP1可能发展成为POF等卵巢疾病新的治疗药物。