水稻矮缩病毒编码的RNA沉默抑制因子与宿主相互作用研究

在病毒与宿主的共进化过程中，宿主为保护其免于病毒侵染而产生抵制病毒入侵的机制，RNA 沉默是方法之一，存在于多种真核生物中。病毒产生的dsRNA是RNA 沉默的诱发因子。病毒编码的RNA 沉默抑制因子(VSR)抑制宿主的RNA 沉默。目前对ssRNA 病毒的VSR 研究较多，而植物dsRNA 病毒VSR研究较少。植物dsRNA 病毒包括多种重要作物的病毒，在植物和传毒介体中复制，很难防治。研究这类病毒VSR 与致病的关系对控制这类病害有重要的意义，病毒如何保护其基因组免于被宿主RNA沉默机制降解也是一个非常有理论意义的课题。我们在发现水稻矮缩病毒编码的两个VSR，Pns10和Pns11，以及病毒组装、进入宿主细胞机制和细胞间运动的基础上，深入研究Pns10和Pns11如何通过与宿主细胞因子如RDR等的相互作用抑制RNA沉默，并引致病害，为探明RDV致病分子机制和控制该类病害提供分子依据。

水稻矮缩病毒RDV是植物呼肠孤病毒的典型代表，由叶蝉以持久性方式传播，并可经卵传播。该类病毒是我国以及东南亚水稻、玉米等作物的重要病原，尚无抗病毒基因报道。. 首先，我们发现RDV沉默抑制因子Pns10可以抑制ssRNA引起的局部和系统RNA沉默,但不能阻止dsRNA诱发的RNA沉默信号的产生。在Pns10转基因烟草中可增强PVX在植株体内的积累和转运,并介导PVX进入转基因烟草分生组织。同时能够在体外结合3’突出2个碱基的21和24bp siRNA，结合siRNA对于Pns10抑制RNA沉默的活性是必须的。Pns10与RNA沉默途径关键基因RDR6可能存在间接地相互作用，可降低RDR6的转录水平。. 其次，研究了RDV和RSV侵染水稻后小RNA表达谱,发现：RSV侵染会诱导水稻miRNA*的积累，而对应的miRNA的表达却没有明显的变化；同时，通过实验证明这些miRNA*具有调控基因表达的功能；RSV在侵染水稻诱导phased siRNA的产生和积累,还能诱导phased miRNA的表达和积累。这些受病毒诱导的phased miRNA和siRNA同样具有调控基因表达的功能。而在RDV侵染水稻中没有发现上述现象，造成这种差异的原因可能是RSV侵染诱导水稻内源RNA沉默通路的OsAGOs和OsDCLs的上调表达。而RDV却只诱导RNA沉默通路的OsRDR1 和RDR2的上调表达，对DCL以及AGO几乎没有影响。. 第三，水稻AGO蛋白在抗病毒中的功能研究。水稻ago1和ago18突变体对RSV和RDV极其敏感，出现矮化、花叶，甚至致死等症状。Northern blot发现RSV和RDV病毒基因组RNA 在ago1和ago18突变体中积累量显著增加。利用AGO1 和AGO18抗体通过免疫沉淀AGO1 和AGO18结合的小RNA测序分析发现AGO1复合体中病毒来源的21nt vsiRNA 明显富集，而AGO18复合体主要结合miRNA, 主要包括miR168等。IP-Northern验证了上述结果，说明AGO1是通过结合病毒vsiRNA参与抗病毒，而AGO18通过结合miR168等抗病毒。过表达AGO18的转基因水稻，抗病性显著增强。以上结果说明AGO18 是一个病毒特异诱导、且具有广谱抗病毒作用的基因。.