Calumein分选途径与生理功能关系的分析

Calumenin (Calu), a CREC protein family member, contains two isoforms (calu-1 and calu-2) in human. We have newly identified thirteen calumenin isoforms (calu-3-15) with different subcellular localizations. In this project, we would like to investigate the precise intracellular localizations and functions of calu-3-15, and focus on the regulatory roles of calu-1/2 on the structure and function of endomembrane system through their sorting pathways. Moreover, we plan to study the extracellular function of calu-1/2, and their relationship with cell migration and tumor metastasis.To elucidate the molecular mechanism of calu-1/2 inhibiting cell migration, we will screen extracellular or membrane associating proteins, and analyze calu-1/2 related cell signaling pathways. Meanwhile, we will determin the relationship between calu-1/2 and tumor metastasis and malignancy by means of overexpression, RNAi and mouse model, as well as tumour sample comparison, which would facilitate the evaluation of calu-1/2 as a biomarker of tomour malignancy diagnosis.We also expect to determin the minimum functional domain of calu-1/2, and provide new clues for the development of anti-cancer drug.

Calumenin (calu)属于CREC家族,人体中已报道有calu-1和calu-2两个异形体。我们发现了13个新calu异形体（calu-3-15），实验结果显示它们具有不同的亚细胞定位。在本项目中，我们将确定13个新异形体的细胞定位和功能，特别分析calu1/2通过不同的分选途径对细胞内膜系统的结构和功能的调控作用。第二，研究分泌到胞外的calu-1/2与细胞迁移和肿瘤转移等的关系。通过寻找calu-1/2在胞外和细胞膜上的相互作用蛋白，分析与calu-1/2及细胞迁移相关的细胞信号通路，阐明其抑制细胞迁移的分子机制。第三，应用过表达、RNA干涉及小鼠模型验等手段分析calu-1/2与肿瘤恶性化程度及转移的关系。通过大量临床肿瘤组织和癌旁组织的比较，探讨将其作为肿瘤恶性化程度指标的可能性。确定calu抑制肿瘤细胞转移的最小功能结构域，为寻找抑制肿瘤细胞转移药物提供新思路。

本项目主要研究了CREC蛋白家族成员calumein（calu）的分选途径与生理功能关系。首先在人细胞中鉴定了13种新的由可变剪接形成的calu异形体 (命名为calu 3- 15)，并发现仅calu-15缺乏信号肽而在细胞核中聚集。Calu-15通过与importin a、Ran GTPase和Crm1结合穿梭于细胞核和细胞质之间。它的73位苏氨酸（Thr-73）被酪蛋白激酶2(CK2)磷酸化对其入核至关重要。在细胞核内，calu-15通过结合到TGF-β超家族成员GDF-15的启动子区域来增加其转录，从而促进丝状伪足形成和细胞迁移。对calu-1/2研究表明，它们主要定位于内质网腔内，但有一部分被分泌到胞外。细胞外calu1/2与fibulin-1和fibronectin形成复合物，通过影响ERK1/2信号通路来抑制细胞迁移与肿瘤细胞转移。在大多数人肝癌和胰脏癌组织中都能检测到calu1/2和fibulin-1 的表达量下降。进一步显示，细胞外calu1/2量减少的肿瘤细胞，其胞外基质成分fibulin-1被MMP-13水解，而calu1/2与fibulin-1的结合使之免受MMP-13的降解。Calu1/2与fibulin-1和fibronectin一起形成复合体，导致fibronectin不能与细胞膜上的syndecan-4和α5β1-integrin结合，从而抑制ERK1/2信号通路和细胞迁移。calu1/2还可以通过与climp63相互作用来调控内质网结构，同时也可以通过调节胞浆钙离子浓度影响高尔基体形态。此外，我们还分析了富含粗面内质网的家蚕后部丝腺细胞中人calu蛋白的同源物BmCREC，发现BmCREC也定位于ER腔内，其C-端四肽HDEF可以被KDEL受体识别, 随后由COPI囊泡逆向运输回ER。缺乏HDEF四肽的BmCREC或COPI亚基降低均使得驻留在ER的BmCREC减少，而增加其分泌量。研究还发现BmCREC敲低会扰乱ER和高尔基体的形态，并导致后部丝腺管扩张缺陷。因此，我们的研究结果揭示了calu1/2和BmCREC是维护ER /高尔基体形态结构所必需的；calu-15通过促进丝状伪足的形成来促进细胞迁移，而calu1/2在胞外通过与fibulin-1和fibronectin的相互作用，而调控ERK1/2信号通路和细胞的迁移起重要作用。