DNA损伤修复大型复合物CSN-CRL4DDB2的结构与功能研究

The COP9 signalsome (Constitutive Photomorphogenic signalosome), also named CSN, is a protein complex common in eukaryotes. CSN possesses various biological functions, including deneddylation, deubiquitination, binding protein kinases, and so on, thus it is involved in multiple regulatory pathways in cell, such as DNA damage repair, cell-cycle control, apoptosis, aging, and gene transcription and expression. CSN participates in ubiquitination pathway through regulating Cullin-RING E3 ubiquitin Ligases (CRLs). CSN can remove the ubiquitin-like protein NEDD8 from CRLs, and bind deneddylated CRLs to maintain them in an inactive state. CRLs is a super family of about 200 complexes in human, in which CRL4 plays an important role in DNA damage repair and genome maintenance. CRL4 consists of cullin4, Rbx1, DDB1 and DCAFs (Ddb1-and Cul4-associate factors). The involvement of CSN in DNA damage repair pathway is closely associated with CRL4DDB2 of CRL4 family. Studies have revealed that CSN binds CRL4DDB2 to repress its activity; when DDB2 recognizes damaged DNA, CSN will dissociate from CRL4DDB2 and cullin4 will be neddylated to activate CRL4DDB2, resulting further DNA damage repair. However, the detailed process remains unclear, including how CSN interacts with CRL4DDB2, and how CSN dissociates from CRL4DDB2 upon DNA recognition. To elucidate the detailed mechanism by which CSN participates in DNA damage repair, we plan to carry out the structural and biochemical studies of CSN-CRL4DDB2 and CSN-CRL4DDB2-DNA supercomplexes.

COP9信号复合体，又称CSN，在真核生物中普遍存在并在细胞中参与多种调控途径。CSN可将类泛素蛋白Nedd8从Cullin-RING E3泛素连接酶（CRLs）的Cullin亚基中解离下来，并且结合CRLs使其保持失活状态。CRLs在泛素化调节途径中起关键作用，其中CRL4 家族在DNA损伤修复以及维持基因稳定性方面有着重要作用。CSN参与DNA损伤修复过程与CRL4 家族的CRL4DDB2密不可分。目前研究认为， CSN结合CRL4DDB2抑制其活性，一旦DDB2识别受损DNA，CSN就会解离，cullin4 发生Nedd化，CRL4DDB2激活，从而促进下一步DNA修复。然而具体细节并不清晰，我们希望通过解析CSN-CRL4DDB2这一大型复合物的结构，并且希望捕捉到CSN-CRL4DDB2结合受损DNA的中间状态，从结构生物学的角度来阐述CSN参与DNA损伤修复的具体机制。

COP9信号复合体，又称CSN，在真核生物中普遍存在并在细胞中参与多种调控途径。CSN可将类泛素蛋白Nedd8从Cullin-RING E3泛素连接酶（CRLs）的Cullin亚基中解离下来，并且结合CRLs使其保持失活状态。CRLs在泛素化调节途径中起关键作用，其中CRL4家族在DNA损伤修复以及维持基因稳定性方面有着重要作用。CSN参与DNA损伤修复过程与CRL4家族的CRL4DDB2密不可分。本项目拟利用X 射线衍射以及电镜技术作为主要研究手段，配合其他生物化学、分子生物学与细胞生物学等方法，系统地开展DNA损伤修复通路中CNS-Cullin4-Rbx1-DDB1大型复合物、CSN-CRL4-DDB2大型复合物及其结合损伤DNA 的结构与功能研究，从结构生物学的角度来阐述CSN参与DNA损伤修复的具体机制。由于CSN-CRL4-DDB2国外已经有报导，所以我们将研究重点稍微调整，主要是深入开展E3泛素连接酶及其他相关复合物的研究。我们开展了关于酵母的一种E3泛素连接酶Elc1、Rad7、Rad16和Cul3的结构与功能研究，解析了Rad7165-565/Elc1Δ32-41晶体结构，通过大量的生化实验确定了Rad16与Rad7的相互作用区域，以及ElC1和Cul3的相互作用区域，从而勾勒出该E3泛素连接酶的作用模式。此外，我们开展了关于T. onnurineus 的III-A型CRISPR-Cas效应复合物的研究，解析了3.35埃的冷冻电镜结构，对其作用机制进行了阐述。我们同时也开展了关于结核分枝杆菌CRISPR/Cas system Csm1的结构与功能研究，我们的结构和突变数据表明palm2结构域中的K692残基在Csm1从聚合酶到环化酶的进化中具有重要意义，并支持Csm1的环化酶活性需要CRISPR / Cas效应子复合物提供的其他元件的存在的观点。该研究将有利于将来针对CRISPR / Cas系统的功能研究和工程设计。