双靶向纳米化miRNA-204治疗心肌缺血再灌注损伤的机制研究

Gene therapy for ischemic heart disease is a research hotspot in the biomedical field, and miRNA is a very promising gene therapy drug in clinic. Our previous study found that miRNA-204 played an important regulatory role in myocardial ischemia-reperfusion (IR) injury. However, the fact of miRNA-204 lacking in vivo myocardial targeting and poor stability greatly limited the therapeutic effect. The emerging nanotechnology in recent years is expected to address this issue. On the basis of the previously studies on magnetic nanoparticle,combined with the consideration of stong complementary effect between magnetic targeting and biotargeting. we intend to introduce polyethylene glycol(enhance the stability), poly(leucine)(load magnetic nanoparticles), and poly(lysine) (load miRNA-204) into the nanoparticle, and coupling ischemic myocardium specific targeting oligopeptide AT1 on the surface of nanoparticle, thus assembled a novel dual-targeted miRNA-204 nanocarrier. Magnetic target combined with bio-target can further enhance the myocardial targeting,which eventually resulted in improved therapeutic effect. With paramagnetic nanoparticles, magnetic resonance imaging (MRI) and simultaneously visualization tracer can be realized, which facilitate the evaluation of the targeting therapeutic effect of miRNA on myocardial IR injury. and the protective effects of miRNA-204 on myocardial IR injury via regulating myocardial autophagy or apoptosis-related target genes will be further investigated. This project is expected to develop new gene therapy drug with independent intellectual property rights, and have great potential in clinical theranostics.

缺血性心脏病的基因治疗是生命医学界的热点，而miRNA是很有临床应用前景的一类基因。我们前期研究发现：miRNA-204在心肌缺血再灌注（IR）损伤中发挥重要的调控作用。但由于miRNA体内的稳定性差且无心肌靶向性，极大限制了疗效，而近年新兴的纳米载体有望解决此问题。鉴于磁靶向与生物靶向的互补性，我们拟在前期研制的磁纳米载体基础上，引入聚乙二醇（提高稳定性和缓释性）、聚亮氨酸（包裹磁纳米）和聚赖氨酸（装载miRNA），再耦联特异性靶向缺血心肌的AT1多肽，组装出双靶向纳米载体。其中"磁靶向"结合磁共振成像示踪技术，可动态评估miRNA对心肌IR损伤的靶向性治疗效果；而"生物靶向"将进一步增强miRNA的心肌靶向性和缓释性，提高疗效。并深入研究miRNA-204如何通过调控心肌自噬和凋亡靶基因，发挥心肌保护作用。本项目有望研发具有自主知识产权的新型基因治疗药物，并具备"诊疗一体化"临床优势。

缺血性心脏病的基因治疗是生命医学界的热点，miRNA是很有临床应用前景的一类基因，而纳米基因载体是克服目前基因治疗中面临困难的有效手段。在此面上项目的资助下，我们对纳米化miRNA在缺血性心脏病中的应用及其相关机制进行了深入研究，现已发表相关文章14篇，其中SCI收录6篇。该项目所取得的学术成绩不仅仅是发表了多篇SCI论著，更重要的成果是培养了多名年轻的科研骨干，本项目先后资助培养了6名研究生。随着该项目的深入研究，又有了新发现和新创意，本项目组成员又申请到3项新的科研项目。本项目研究中，我们成功合成了一种可特异性靶向于梗死心肌的纳米载体，该纳米载体内核为阳离子聚合物—树枝状聚赖氨酸（DGL），外壳为亲水性的聚乙二醇，表面链接有靶向分子AT1（可特异性与梗死心肌中升高的血管紧张素II受体（AT1R）结合），该纳米载体可成功负载miRNA形成粒径约200 nm的纳米颗粒。该纳米颗粒具有细胞毒性低、生物安全性高、稳定性高的特点。我们在缺氧/复氧原代心肌细胞模型以及心肌梗死模型上证实了该靶向纳米载体对缺氧心肌细胞和梗死心肌的特异性靶向效能。我们在细胞水平证实了该靶向纳米载体可将miRNA-1 inhibitor转染至心肌细胞中，其转染效能与传统纳米载体聚乙烯亚胺（PEI）相当，但毒性远远低于PEI。在小鼠心肌梗死模型上，我们证实了该靶向纳米载体可将miRNA-1 inhibitor靶向递送至梗死的心肌部位，明显下调梗死心肌中miRNA-1（miRNA-1在梗死心肌中表达水平升高），并明显上调抗凋亡蛋白Bcl-2和PKCε的表达水平（Bcl-2和PKCε在梗死心肌中表达水平降低）。我们进一步证实了心肌靶向纳米载体负载miRNA-1 inhibitor可减少心肌细胞凋亡，减小心肌梗死面积，减少心肌纤维化程度，同时可改善小鼠心脏功能。本项目为阐明miRNA在心肌梗死发生发展中调控作用提供实验依据，本项目构建的心肌靶向纳米载体为心肌梗死的基因治疗提供了新策略，有望为临床心肌梗死患者的治疗提供新的思路。