低剂量抗PD-1抗体对ANXA3抗原特异性CTLs抗肝癌作用的影响和机制研究

Hepatocllular carcinoma cancer stem-like cells (HCC CSCs) might be the source of tumor relapse and metastasis. In the previous work we demonstrated that ANXA3 antigen specific CTLs could preferentially kill HCC CSCs and inhibit tumor growth in nude mice. However, HCC CSCs survived in the residual disease after CTLs treatment, which might be correlated with the CTLs function inhibition by the tumor cells via PD-1/PD-L1 axis. Besides, the mechnism of HCC CSCs immune escaping and the role of anti-PD-1 antibody in the anti-tumor action of ANXA3 antigen specific CTLs for HCC remains unkown. In this project, we investigate the immune suppression of HCC CSCs and its effect on ANXA3 antigen specific CTLs by immunochemistry and flow cytometry. Moreover, The optimal dose of anti-PD-1 antibody will be explored, and the role of low dose anti-PD-1 antibody in the anti-tumor action and infiltration ability of ANXA3 antigen specific CTLs for HCC will be evaluated as well by multiple approaches, inculding co-culture assasys, protein chip, lentivirus mediated gene delivery and immunocompetent mouse experiments, thus, elucidating the mechnism how low dose anti-PD-1 enhance the anti-tumor action of ANXA3 antigen specific CTLs and providing novel clues and therapeutic strategies for HCC patients.

肝癌干细胞被认为是肝癌治疗后复发和转移的一个重要根源。我们前期研究发现ANXA3抗原特异性CTLs能靶向杀伤肝癌干细胞，抑制小鼠肝癌生长，但治疗后的小鼠肝癌组织仍残存肝癌干细胞，这可能与肿瘤细胞通过PD-1/PD-L1轴抑制CTLs抗肿瘤作用有关。而目前有关肝癌干细胞免疫逃逸的机制，以及抗PD-1抗体对ANXA3抗原特异性CTLs抗肝癌作用的影响及其机制尚不清楚。本项目拟继续研究肝癌干细胞的免疫抑制作用及其对ANXA3抗原特异性CTLs免疫功能的影响；探索ANXA3抗原特异性CTLs抗肝癌作用最强时所需的最低抗PD-1抗体剂量，并分析其对CTLs迁移能力的影响和机制；最后用动物模型分析低剂量抗PD-1抗体对ANXA3抗原特异性CTLs瘤内迁移浸润和免疫微环境的影响，以期阐明低剂量抗PD-1抗体增强ANXA3抗原特异性CTLs抗肝癌作用的机制，为将来开展肝癌新的免疫治疗方法提供理论依据。

我们前期工作发现PD-1/PD-L1轴是抑制细胞毒性T淋巴细胞抗肝癌作用的一个重要原因。本项目在前期工作基础上，我们深入分析了肝癌细胞免疫逃逸的机制，以及PD-1抗体对T淋巴细胞抗肝癌作用的影响和机制。首先，将T淋巴细胞与肝癌细胞共培养，以及构建肝癌小鼠移植瘤治疗模型，通过体内外实验发现肝癌细胞通过上调PD-L1的表达逃避T淋巴细胞免疫杀伤。进一步在肝癌微环境中，我们检测了肝癌组织中ANXA3、CD3、CD15和CD34的表达水平，发现肝癌组织中ANXA3表达与浸润的中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）、肿瘤血管生成呈正相关；相关机制研究发现肝癌细胞中ANXA3分别通过CXCL8、CCL25、PDGF-AA等分泌蛋白调控中性粒细胞、T淋巴细胞的瘤内浸润和内皮细胞的血管生成活性，诱导抑制性免疫微环境的形成，导致肝癌免疫逃逸。其次，通过外源性加入低剂量PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1信号轴的方法，发现低剂量PD-1抗体通过调控IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-10和IL-6等细胞因子的分泌，以及Granzym B等细胞毒性介质的分泌影响T淋巴细胞的抗肝癌作用。最后，我们分析了在肿瘤微环境局部分泌的PD-1单链抗体对T细胞抗肝癌作用的影响。通过构建可在肝癌微环境局部自分泌PD-1单链抗体（scFv）的CD133特异性嵌合抗原受体T细胞（PD-1/CD133 CAR-T细胞），发现PD-1/CD133 CAR-T细胞具有更强的肿瘤组织浸润能力，更强的特异性杀伤CD133+肝癌干细胞的能力。这些结果提示肝癌微环境局部分泌的PD-1单链抗体通过重塑肿瘤微环境促进CAR-T细胞的瘤内浸润，增强CAR-T细胞的抗肝癌作用。总而言之，本项目研究表明肝癌细胞通过诱导抑制性免疫微环境形成等途径发生免疫逃逸，外源性加入或内源性表达PD-1抗体都可以解除肿瘤微环境的免疫抑制，促进T细胞的抗肝癌作用，这为今后开展肝癌T细胞免疫治疗奠定研究基础。