分子结构调控核酸适配体与蛋白特异性识别的原位超低场力谱研究

The study of protein based on aptamers is filled with new opportunity and challenge on the applications such as biosensor and medical diagnosis. But the mechanism of aptamer-protein interactions and regulation is unclear due to the absence of suitable method for direct measurement. In the present project, without the change of G-quadruplex, we propose to investigate the interactions between thrombin and its aptamers with different DNA chain and complementary DNA sequence. By means of the direct and indirect measurement of ultra low field force spectroscopy, the quantitative analysis of binding force will be studied in details. The in situ force spectroscopy will be obtained via microfluidic method to provide the kinetic informations. The results will reveal the regulation mechanisms of intermolecular interaction by structure variety. With the help of other biophysical methods, the comprehensive analysis of the structure effect on interaction, binding ability and thrombin activity will be discussed. The method and results will be expanded to other protein and aptamers. It is of great importance for the improvement of knowledge of aptamers’ molecular recognition, regulation mechanisms and DNA-protein interactions, may provide theoretical basis for the aptamer-based diagnosis and treatment of major diseases.

基于核酸适配体的蛋白质研究在生物传感器和医学诊疗等应用方面正面临新的机遇和挑战。然而核酸适配体与蛋白相互作用的分子机理和调控机制仍不甚清楚。本项目以凝血酶及其核酸适配体为分子模型，以核酸适配体分子链结构和互补DNA序列结构为切入点，研究分子结构调控核酸适配体与蛋白特异性识别的机制。拟重点采用新型的超低场力谱技术，在超低磁场中以磁性粒子为分子探针，通过直接法和间接法两种方案，从束缚状态到自由状态对相互作用力进行精确测量；并且利用微流控方法产生原位在线的力谱，提供解离动力学信息，进而阐明分子结构调控特异性识别的机制；同时结合多种技术手段，综合分析核酸适配体与凝血酶的作用方式、结合能力及凝血活性的调控机制，并将研究方法和结果扩展到其他蛋白。通过此项研究，既可深入理解分子结构调控核酸适配体与蛋白特异性识别的机制，也将丰富核酸与蛋白相互作用的认识，为基于核酸适配体的临床诊断和疾病治疗提供理论基础。

核酸适配体作为一种与抗体相媲美的新型识别分子，因其具有高亲和力及特异性等优越性，近年来在生物传感器、生物标志物发现、癌细胞检测、治疗新药等方面展现了重要的应用前景。但是核酸适配体如何特异性识别靶蛋白的科学问题尚不清楚。它们之间相互作用机理的研究是阐明这一科学问题的关键，将有助于核酸适配体的筛选、结构优化，拓展在新药分子研发、重大疾病早期诊断和靶向治疗中的实际应用。本项目重点采用新型的超低场力谱技术，围绕蛋白与核酸适配体结合力的定量分析和分子结构调控相互作用的分子机制展开研究；利用微流控方法，结合超低场磁力仪，原位探测生物分子特异性识别，拓展超低场力谱技术的基础应用研究。通过本项研究，在深入理解核酸适配体对蛋白特异性识别的分子结构调控机制的同时，也丰富了核酸与蛋白相互作用的认识，为基于核酸适配体的临床诊断和疾病治疗提供了理论基础。项目主要成果及创新点如下：.1、.通过自组装和级次结构的设计，构建新型的超低场磁探针，实现了超低场磁探针对单分散和高剩磁的要求，为后续的实验计划提供了有力保障。.2、.采用微流控技术建立原位在线的超低场力谱新方法，实现了双链DNA单碱基识别的力谱测量，避免了样品在信号测量与施加外力过程中的反复转移。.3、.通过超低场的力谱技术（直接法）和交换技术（间接法）两种测量方案，系统研究了凝血酶束缚状态及自由状态与其核酸适配体的结合力，提出了核酸适配体与蛋白相互作用的核酸序列和机械力双重调控的新机制。.4、.采用超低场力谱技术，深入研究了凝血酶与其核酸适配体的多价态相互作用，以及Ku蛋白核酸适配体及药物小分子的相互作用，为基于多价态作用的高性能配体分子设计提供了研究平台。.5、.在不改变G-四链体结构的条件下，以核酸链结构和互补序列结构为切入点，研究了核酸适配体与肿瘤标志物蛋白的相互作用，建立了同时检测多种蛋白分子的力编码新技术。并在此基础上，探索了肿瘤细胞及细菌的检测。