miR-125b调控奶牛乳腺炎的分子机制

Previous study in our group revealed that, miR-125b gene expression of the mammary tissues significantly decreased in dairy cattle with mastitis compared with the healthy dairy cattle, and informatics analysis results showed that miR-125b might regulate many genes involved in bovine immunity. The results metioned above suggested that miR-125b might play important roles on bovine mastitis. However, there is no report on the molecular machanism of miR-125b regulating on mastitis in dairy cattle until now. Therefore, in this study, many methods, such as dual luciferase reporter gene assay, gene overexpression, gene silencing, immunofluorescence, qPCR, flow cytometry, will be used to perform the experiments as follows: Firstly, the target genes of bovine miR-125b will be identified. Secondly, the spatio-temportal expression pattern will be detected, and molecular mechanism of miR-125b on mastitis will be clarified during the process of inflammatory response in bovine mammary epithelial cells. Thirdly, SNPs of miR-125b precursor gene and its target genes will be detected, and their effects on binding efficiency between miR-125b and target genes will be identified. Finally, the correlation analysis between SNPs and mastitis will be performed in order to screen the molecular marker loci for mastitis resistance. The results of this project will reveal the function and molecular mechanism of miR-125b on mastitis, which will be the foundations for clarifying the gene network on mastitis, and will provide the new molecular materials for mastitis resistance molecular breeding.

前期实验结果表明，与健康奶牛相比，miR-125b在乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达量显著降低，靶基因预测结果显示miR-125b可能调控多个免疫基因，该结果提示miR-125b可能在奶牛乳腺炎中有重要调控作用。迄今为止尚未见miR-125b调控奶牛乳腺炎的报道。因此，本项目拟采用双荧光素酶报告基因实验、基因超表达、基因沉默、免疫荧光、qPCR、流式细胞等实验技术，鉴定miR-125b的靶基因；研究miR-125b在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应过程中的动态表达模式和分子作用机制；筛查miR-125b前体基因及其靶基因结合位点的SNPs，鉴定SNPs对miR-125b与靶基因结合效率的影响；进行SNPs与奶牛乳腺炎的关联分析，以期筛选与奶牛乳腺炎密切相关的分子标记位点。研究结果将阐明miR-125b在奶牛乳腺炎中的分子调控机制，为解析奶牛乳腺炎的基因网络奠定基础，为乳腺炎抗性分子育种提供新的分子依据。

本研究采用双荧光素酶报告基因实验、细胞培养、细胞炎症诱导、miRNA超表达与沉默、定量PCR、流式细胞等技术研究了miR-125b在乳腺组织和乳腺上皮细胞中的表达模式，阐明了miR-125b在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的分子作用机制。此外，还进行了奶牛乳腺炎差异表达miRNA的筛选。获得了如下主要结果：.1、miR-125b靶基因鉴定：在靶基因预测基础之上，利用双荧光素酶报告基因载体实验技术鉴定了miR-125b的靶基因，结果显示NKIRAS2基因为牛miR-125b的靶基因。.2、miR-125b表达模式研究：本研究克隆了miR-125b的前体基因，并进行了表达模式分析，结果表明，与健康奶牛相比，miR-125b在临床乳房炎奶牛、S.aureus诱导和E.coli诱导的乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达量均显著下降。此外，与对照组相比，miR-125b在LPS诱导乳腺上皮细胞后3h的表达量无显著变化，在诱导后的6、12和24h细胞内的表达显著降低。.3、miR-125b在乳腺上皮细胞炎症反应中的分子作用机制：体外培养牛乳腺上皮细胞，在LPS诱导细胞产生炎症反应的基础上，利用miR-125b过表达和沉默实验，首次证实了miR-125b可靶向抑制NKIRAS2基因的表达，促进NF-κB表达上调，使得NF-κB依赖的主要炎症因子TNFα、IL-6和IL-8的表达量显著上调，从而调节了炎症反应和免疫应答过程。此外，还发现miR-125b可降低奶牛乳腺上皮细胞的凋亡率。.4、奶牛乳腺炎差异表达miRNA的筛选：与对照组相比，在S.aureus诱导组乳腺组织中共获得279个差异表达miRNA（173个已知miRNA和106个新预测miRNA），其中186个miRNA表达上调，93个miRNA表达下调；在E.coli感染乳腺组织有305个差异表达miRNA（190个已知miRNA，115个新预测miRNA），其中243个miRNA表达显著上调，62个miRNA表达显著下调。这些差异表达的miRNA共同参与了包括TLRs信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体作用信号通路、白细胞跨内皮迁移等在内的多个关键免疫信号通路，以调节奶牛乳腺炎的发生和发展过程。.上述研究结果可为奶牛乳房炎的分子调控网络解析奠定了基础，为奶牛乳腺炎抗性分子育种提供了新的分子依据，具有潜在的应用价值。