基于分子机制的食物蛋白质酶解改性机理研究

本项目以酪蛋白-胰蛋白酶的模式水解体系作为研究对象,研究酪蛋白及其组分对胰蛋白酶的敏感性差异，结合酶解产物宏观及微观结构的变化规律，阐明蛋白质组成及结构与酶解敏感性之间的内在关系；依据蛋白质结构信息, 对胰蛋白酶作用于酪蛋白时的酶解断裂位点进行剖析,比对酪蛋白及其组分酶解前后结构及组成差异，分析判定酪蛋白中"阻抗性肽键"的分布及结构特点，探讨"阻抗性肽键"对酶解特性的影响机理；依据蛋白质分子二级结构、表面疏水性、表面结构特征、构象、分子量分布、变性热焓/变性温度等变化规律及"阻抗性肽键"的消减，结合变性蛋白酶解特性的变化，探讨酶解前蛋白质适度变性的机理，在此基础上总结基于分子机制的食物蛋白质酶解改性机理。其中"阻抗性肽键"对蛋白质酶解特性的影响机理及酶解前蛋白质适度变性机理研究尚未见文献报道。该研究可以从分子水平上揭示食物蛋白质酶解改性的机理，为食物蛋白质酶解工业及酶解控制奠定理论基础。

本项目利用酪蛋白-胰蛋白酶水解体系研究食物蛋白的酶解改性机理。研究表明酪蛋白(CN)的水解度随着酶解过程的进行呈两个不同的阶段：初始的近似直线升高阶段和随后缓慢增加并保持在相对稳定的阶段。HPSEC及SDS-PAGE分析表明：酪蛋白的不同组分对胰蛋白酶的敏感性不同，γ-CN、к-CN组分最敏感，肽键容易被酶切断形成游离氨基酸或者小分子的肽段，α-CN敏感程度中等，而β- CN敏感性最低，在其它组分几乎被分解的情况下，仍然保持一部分的相对完整性，说明在β-CN中部分肽键很难被酶解，属于“阻抗性肽键”。酪蛋白酶解产物中β-折叠减少，而β-转角增多，α-CN的酶解产物β-转角含量增加显著，β-CN酶解产物中β-折叠结构含量下降明显，κ-CN酶解产物中α-螺旋和β-折叠的含量变化不明显。酪蛋白酶解产物中出现短时间的凝聚，α-CN酶解产物的粒度分布趋于集中，粒径变小，β-CN酶解产物中粒度分布变化不明显，κ-CN酶解初始阶段粒度变化明显，随后和α-酪蛋白变化趋势类似。β-CN酶解产物SDS-PAGE图谱中Mr为9.4kDa的谱带在酶解过程中保持不变，推测该谱带代表的肽即为阻碍酪蛋白酶解的部分，含有“阻抗性肽键”。.超声波和磷酸化处理后酪蛋白水解度及酶解产物中氨基氮含量均显著提高，SDS-PAGE及HPSEC分析表明：预处理后酪蛋白中高分子量多肽含量下降，酶解过程中，预处理的酪蛋白酶解产物分子量较小，高分子量肽段(10-20 kDa和> 20 kDa)含量较对照显著减少；二级结构变化表现为预处理导致酪蛋白α-螺旋/β-折叠比值下降，酶解产物较对照酶解产物的α-螺旋/β-折叠下降更加明显；酶解导致酪蛋白在溶液中的颗粒粒径迅速减小，且预处理能够显著降低酪蛋白溶液中大粒径颗粒的含量，其酶解产物粒径远远小于对照样品；表面结构变化发现酶解使得酪蛋白结构疏松多孔，预处理能够破坏酪蛋白胶团的致密结构，使其结构疏松，有利于与酶的结合，促进酶解的进行。不同超声波功率、不同磷酸化程度处理后酪蛋白的酶解特性、粒度分布、分子量分布及结构特性均存在明显差异。. 经过物理、化学方法预处理，使酪蛋白分子组成和结构发生改变，特别是减弱或破坏了β-酪蛋白中“阻抗性肽键”的数量和分布，使酪蛋白分子柔性增加，对酶的敏感性提高，从而易于被酶解。该研究为从分子水平上揭示食物蛋白质酶解改性机理奠定了理论基础。