自然流产防治新靶标：miR-365调控滋养层细胞凋亡的机制研究

miR-365 is a miRNA expressed highly in human decidual tissue of spontaneous abortion identified by miRNAs microarray.Our previous study found that the expression of miR-365 maintained very low level with the trophoblast cell, and miR-365 overexpression could promote the apoptosis of trophoblast cell and cell cycle arrest. Moreover, the results from bioinformatics analysis and preliminary experiment showed miR-365 could modulate SGK1 signaling pathway, all of these results provided evidence that miR-365/SGK1 signaling pathway might play an important role in trophoblast cell apoptosis and spontaneous abortion. The study will verify the relationship between miR-365 and spontaneous abortion. We will explore the function of miR-365 in trophoblast cell apoptosis via overexpression and knock down strategies. Then we will use rescue experiment strategy to analyze the downstream regulation mechanism of miR-365 modulating SGK1 signaling pathway. Furthermore, we will evaluate the function and mechanism of miR-365 in vivo by transfecting pregnant mice. The study will help us understand the mechanism of trophoblast cell apoptosis and spontaneous abortion, and also provide new clue and potential intervention target of control spontaneous abortion.

miR-365是我们前期应用miRNA芯片筛选到的一条在自然流产蜕膜组织中差异高表达、在自然流产中功能未知的miRNA。前期发现，miR-365过表达可显著促进滋养层细胞凋亡及细胞周期阻滞；生物信息学及实验均证实miR-365靶向调控SGK1信号通路；SGK1蛋白低表达于自然流产蜕膜组织中，提示miR-365可能通过调控SGK1信号通路参与滋养层细胞的凋亡及自然流产的发生。研究拟进一步临床论证miR-365与自然流产关系；以过表达、沉默策略，从正反两方面论证miR-365在滋养层细胞凋亡中的作用；以挽救实验策略，论证miR-365通过调控SGK1信号通路影响滋养层细胞凋亡的调控机制；并通过孕鼠模型，在体评估miR-365的功能与机制。miR-365影响滋养层细胞凋亡及自然流产的作用与机制均未见文献报道，本研究可为自然流产的防治提供新线索、新靶标。

自然流产是一种因孕卵缺陷和/或母体存在不利妊娠因素导致妊娠早期胚胎停止发育（简称早期胚胎停育）而流产的病理妊娠过程，发生率占全部妊娠的10-15%，鉴于自然流产已是严重影响育龄妇女身心健康的一个重要公共卫生问题，探讨自然流产的病因及发生机制一直是预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。.本研究获得了差异表达的8个miRNAs，其中miR-365 mimic不但可以抑制MDM2活性，还能显著加强p53的活性。进一步验证发现miR-365过表达组：① 凋亡小体形成；② 细胞凋亡率显著增加；③ 细胞周期进程阻滞于G1期；④ 调控滋养层细胞生长关键基因MDM2的表达显著下调，促滋养层细胞凋亡基因p53的表达显著上调。为进一步论证miR-365的功能，诱导生殖力正常的孕鼠胎盘特异性表达miR-365，结果发现，该miRNA促使滋养层细胞凋亡小体形成，而细胞膜、细胞器却相对完整，呈现出细胞凋亡的典型特征，蜕膜组织中滋养层细胞凋亡显著增加；且随着妊娠天数增加，孕鼠流产率大幅提升。.以上述分析结果为研究线索，我们采用Real time PCR进一步筛选可能的靶基因，来寻找miR-365作用的下游靶标。结果发现，SGK1的3’UTR萤光素酶报告系统的活性可被miR-365显著抑制，据此，我们已有充分理由认为miR-365直接靶向调控SGK信号通路的关键分子SGK1。我们还以不同类型流产者蜕膜组织样本，对SGK1基因的表达加以验证。结果发现，SGK信号通路中SGK1基因在自然流产者蜕膜组织中表达水平显著下调，与miR-365的表达呈现负相关关系。进一步构建SGK1 shRNA沉默慢病毒载体，感染HTR-8/SVneo滋养层细胞，检测细胞凋亡及细胞周期进程的变化，也获得了SGK1在滋养层细胞直接调控细胞凋亡、细胞周期进程的证据。.由于miR-365是我们从前期研究采集的临床样本中获得的、与滋养层细胞凋亡及自然流产相关的miRNA，目前尚无该miRNA在自然流产中生物学属性、及与自然流产关系的作用机制报道，因此本课题研究具有源头创新。同时，人miR-365高度保守，阐明其性质、功能及对滋养层细胞凋亡、自然流产的影响，无疑将有助于降低早期胚胎停育，因此具备了重要的临床研究价值。