冲击波通过嘌呤受体调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化增殖的机制

Shockwaves, acting as a kind of mechanical stimulation, can induce the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) without other osteogenic inductive reagents. This is unique, which may be the mechanism by which shockwaves promotes bone healing of nonunion fractures. Our preliminary data indicated that shockwaves released cellular ATP that activated P2X7 receptors (a kind of purinoceptors ) and downstream signaling events that caused osteogenic differentiation of hMSCs. But other researches showed that adenosine (degradation product of ATP) was able to enhance the osteogenic differentiation of MSCs by activation the P1 receptors (another purinoceptors). Those results imply that shockwave may trigger the osteogenic differentiation of MSCs via activation of P2X7 receptors, and enhance the osteogenic differentiation by the activation of P1 receptors. It is not reported whether and how shockwaves induce the osteogenic differentiation of MSCs via both activation of P2X7 receptors and P1 receptors. Our project aims to investigate the mechanism throughly, which might underscore the therapeutic potential of shockwave therapy for the treatment of orthopedic diseases and give a hand in finding new medical therapy to cure nonunion fractures or prevent the heterotopic ossification.

冲击波，作为一种物理刺激，不需要其他化学诱导剂辅助，可直接诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化。这点是与众不同的，可能是冲击波治疗骨不连的机制所在。前期工作显示：冲击波引起的三磷酸腺苷（ATP）向细胞外释放，能够有效激活P2X7受体（一种嘌呤受体）信号传导通路，引起MSCs向成骨细胞分化。但是，另有研究显示：腺苷（ATP的降解产物）能够通过激活腺苷受体（另一种嘌呤受体），有效增加已经骨分化的MSCs增殖。这暗示：冲击波通过P2X7受体信号通路诱导MSCs向成骨细胞分化，再通过腺苷受体信号通路调节已分化细胞的增殖，分化和增殖是由不同信号通路控制的。国内外未见这方面的报道。本课题以此为切入点，通过体内和体外实验，研究在冲击波诱导MSCs向成骨细胞分化增殖过程中，嘌呤受体的变化和作用。这将扩大冲击波对骨科疾病的治疗潜能，为开发促进骨折愈合和防治异位骨化的新药提供理论依据。

近期冲击波被用来治疗骨不连和促进骨折愈合，并且取得了非常好的疗效。这样我们研究：冲击波是否促使细胞内的三磷酸腺苷（ATP）和腺苷向细胞外释放，诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化为成骨细胞或软骨细胞，在这一过程中ATP和腺苷所起的作用。用冲击波处理培养的hMSCs，并评估ATP和腺苷的释放。通过检查碱性磷酸酶活性，骨钙素产生和钙结节形成,来评估hMSCs的成骨分化和矿化。用实时逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定P2X7受体（ATP受体）、A2B 受体 (A2BR，腺苷受体)和c-fos和c-jun mRNA的表达。用P2X7-siRNA，腺苷三磷酸双磷酸酶，P2受体拮抗剂和p38MAPK抑制剂，来评估ATP释放、P2X7受体和p38MAPK信号传导通路在冲击波诱导的成骨hMSCs分化中的作用。我们发现：冲击波引起hMSCs释放大量的（7μM）ATP。冲击波和外源性ATP诱导c-fos和c-jun mRNA转录，p38 MAPK活化和hMSC分化。用腺苷三磷酸双磷酸酶去除ATP，用P2X7-siRNA或选择性拮抗剂靶向P2X7受体，或用SB203580阻断p38MAPK磷酸化，可抑制hMSCs的成骨分化；另外，冲击波可以引起hMSCs 细胞内的腺苷向细胞外释放。冲击波可以引起3D培养状态下的hMSCs 细胞的A2B 受体 (A2BR)表达水平增加。冲击波、细胞外的腺苷和特异性的A2B受体激动剂，通过下调软骨聚集蛋白聚糖(ACAN)、胶原I型蛋白-A2(COL1A2)、胶原II型蛋白-A1(COL2A1)、性别决定区- YBox 9(SOX9)和性别决定区- YBox 6，有效抑制hMSCs 细胞向成软骨分化。A2BR受体的特异性抑制剂有效诱导hMSCs向软骨分化。我们的研究结果表明，冲击波释放细胞ATP，激活P2X7受体和下游信号通路，导致hMSCs的成骨分化；同时，冲击波通过诱导腺苷释放，激活A2B受体抑制hMSC向成软骨转化。我们得出结论，冲击波疗法通过P2X7受体信号传导促进骨愈合，这有助于hMSC成骨分化；但是同时通过A2B受体，抑制hMSC向成软骨转化。这一结果揭示了冲击波促进骨折愈合的机制所在。对冲击波的应用和推广有很大的指导意义。