补肾活血促排方抑制HMGB1介导的卵巢颗粒细胞凋亡治疗多囊卵巢综合征的研究

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common refractory gynecologic disease in clinic, and it is still lack of effective treatment. Our work group therefor, developed the prescription of Bushenhuoxuecupai decoction .And the clinical practice showed a good effect with this decoction . Our previous clinical and animal studies found that an increased high-mobility group box 1 (HMGB1) in the serum from women with PCOS and insulin resistance/hyperinsulinemia. Furthermore, we discovered that high concentration of HMGB1 promoted apoptosis in primary cultured rat ovarian granulosa cells (GCs).And our further study found that Insulin resistance remodeled the chromatin structure nearby the HMGB1 transcriptional initation site, which promoted the expression of HMGB1 by epigenetic methods.We intend to identify our decoction can inhibit GC apoptosis induced by hyperinsulinemia；and to explore the molecular mechanism underlying the treatment of the decoction on anovulatory infertility from primary cultured rat GCs level and rat level with much kind ofmolecular biotechnologies （chromatin immunoprecipitation assay, slow virus vector, exogenous inhibitors and enhancer, etc）.Our result will not only be helpful for clarifying the molecular mechanism underlying the treatment of Bushenhuoxue on PCOS but also providing the scientific proof for its widely applying in PCOS treatment.

多囊卵巢综合征（PCOS）是临床常见的难治性妇科疾病，目前尚缺乏有效的治疗手段。申请人在长期的临床实践中发现补肾活血促排方能够有效改善PCOS患者的临床症状，并通过临床检测与动物试验发现伴有胰岛素抵抗的PCOS患者外周血中HMGB1异常升高，而HMGB1能够导致大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。进一步研究表明，胰岛素抵抗处理下的细胞HMGB1转录起始位点附近的染色质结构出现重塑，呈现明显的开放状态，有助于提高HMGB1的表达水平。由此推测，抑制HMGB1的分泌或表达是治疗PCOS的有效途径，HMGB1极有可能就是补肾活血促排方治疗PCOS的靶点。本课题拟应用染色质免疫共沉淀、RNA干扰等技术在体内外明确补肾活血促排方抑制HMGB1诱导的PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的作用及其分子机制，为补肾活血法治疗PCOS阐明理论基础，也为其在PCOS治疗领域的广泛推广提供科学依据。

本课题组采用的补肾活血促排方由古方筛选加减化裁而来。全方起助阳活血之效，促使阴盛阳动，进而排卵。前期研究结果表明：补肾活血促排方可明显促进多囊卵巢综合征（PCOS）患者排卵，并可明显改善PCOS模型大鼠多囊卵巢，其机制可能与抑制HMGB1介导的卵巢颗粒细胞凋亡有关。此外，我们还发现，卵巢颗粒细胞在胰岛素抵抗状态下能够募集组蛋白乙酰化酶p300，导致HMGB1转录启动子处于开放状态，RNA多聚酶Pol II顺利进入启动子区域，激活HMGB1的转录。本课题组以此为依据提出“补肾活血促排方通过抑制HMGB1下游信号通路或调控HMGB1启动子激活改善多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞凋亡、性激素分泌和促进卵泡发育”的假说。通过分离大鼠卵巢颗粒细胞进行原代培养、构建HMGB1基因敲低和过表达细胞模型，以及建立大鼠PCOS动物模型和HMGB1基因过表达动物模型，在检测卵巢的形态学改变的同时，采用Elisa方法，检测大鼠血清性激素（E2、LH和T）、HMGB1及TNF-α表达水平；同时，采用Elisa方法检测KNG细胞中HMGB1、E2、T的表达水平；采用Western-blot技术检测卵巢组织凋亡相关蛋白BCL2、c-Caspase3、Caspase3及BAX的表达；同时，采用Western-blot技术检测KNG细胞中凋亡相关蛋白BAX的表达；采用CCK8、流式细胞术检测KNG细胞凋亡及增殖情况；采用RT-PCR及Western-blot技术检测凋亡相关的MAPK信号通路中P38、JNK和ERK的mRNA及蛋白表达。实验结果初步显示补肾活血促排方同时具有改善性激素分泌，改善卵巢多囊性改变，改善卵巢颗粒细胞凋亡等多重功效，其机制可能与抑制卵巢颗粒细胞HMGB1的表达，并影响下游细胞凋亡相关分子有关。本项目探讨了补肾活血促排方作为HMGB1抑制剂改善PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的可能机制，并初步揭示补肾活血中药在治疗妇科疾病中的重要性，促进临床应用。