甲基营养菌Methylobacterium.sp MB200中L-丝氨酸反馈调节的机理研究

甲基营养细菌（Methylotrophic bacteria）是一类能够以不含C-C键的低碳化合物为唯一碳源进行生长的微生物，可以转化廉价的单碳化合物生产包括L-丝氨酸在内的多种有价值的代谢产物。本课题组在前期的研究中发现了两个与L-丝氨酸反馈调节相关的基因，在已有的报道中并未发现这两个基因有被反馈调节的作用。本项目旨在前期工作的基础上，利用质粒转座子插入突变技术构建菌株MB200的突变体库；从抗L-丝氨酸结构类似物的突变体中克隆更多与L-丝氨酸反馈调节相关的基因，研究这些基因的功能及可能的作用位点，通过反馈调节效应验证找到L-丝氨酸对甲基营养菌反馈调节作用的关键位点，进一步利用蛋白组学研究技术，分析鉴定基因表达产物及其功能，阐述其作用的分子机理。为解决甲基营养菌在生产中受L-丝氨酸反馈阻遏或反馈抑制影响的难题提供依据，为提高甲基营养菌生产L-丝氨酸时的转化率提供更多的解决方案。

甲基营养菌被定义为“能够利用包含一个或多个碳原子但不含碳碳键的低碳复合物生长的一类微生物”，它的代谢途径特殊且应用广泛，因此研究该类菌的代谢与调节机制无论从理论上还是实际应用上都具有重要的意义。.本研究利用质粒转座子插入突变技术构建了菌株Methylobacteria MB200的突变体库；从抗L-丝氨酸结构类似物的突变体中克隆了多个与L-丝氨酸反馈调节相关的基因，如3-磷酸甘油酸脱氢酶基因（serA）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（pgdh ）等基因，在对3-磷酸甘油酸脱氢酶C末端的ACT功能域上的L-丝氨酸结合位点进行突变后，酶活检测时，L-丝氨酸浓度达到40 µM时，野生型PGDH酶活降低了约33%，但突变的PGDH酶活基本不变且对L-丝氨酸浓度变化不敏感。发酵产L-丝氨酸的分析发现，突变后的菌株是野生型菌株产L-丝氨酸能力的2.6倍。pgdh基因的缺失突变菌、189、196位点的定点突变菌、回补菌的酶活力下降， 只有过量表达菌的酶活上升。缺失突变体由于缺失了pgdh基因，故而6-磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶酶活大幅下降，而189、196位点的定点突变体酶活力也下降，表明189位和196位氨基酸对M. sp. MB200 6-磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶酶活起着重要作用，可能是该酶酶活性的关键性位点。进一步发酵产L-丝氨酸研究发现，突变菌株相对于野生型菌株有较大幅度提高。另外，本研究利用TAIL-PCR的方法克隆到了mxaF基因的全序列，该基因的突变体表现为甲醇营养缺陷；mxaF基因部分序列的系统发生学分析表明，它和M. sp. MB200 16S rDNA一样处于相同的进化位置；通过表达载体pCM80过量表达mxaF基因构建了重组体CH801，其甲醇脱氢酶酶活比MB200提高了约6.2倍，L-丝氨酸产量提高了2.5倍。在研究M. sp. MB200生产L-丝氨酸方面，mxaF基因也是提高L-丝氨酸产量的一个潜在的位点。.实验结果为解决甲基营养菌在生产中受L-丝氨酸反馈阻遏或反馈抑制影响的难题提供依据，为提高甲基营养菌生产L-丝氨酸时的转化率提供更多的解决方案。下一步还可以对筛选到的其他基因进行功能和反馈调节效应验证，找到L-丝氨酸对甲基营养菌反馈调节作用的关键位点，分析鉴定基因表达产物及其功能，阐述其作用的分子机理。