基于循环外泌体的食管鳞癌早期诊断非编码RNA分子标记物的筛选、验证及机制研究

Previous studies indicate that the five-year survival rate for patients with early-stage esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is approximately 10 times higher than that for those with late-stage ESCC. Presently, however, only 15% of ESCC patients can be diagnosed at early stage. Thus, there is an urgent need to identify better method for early diagnosis. Recently, it has been found that tumor cells can release exosomes that contain non-coding RNAs (ncRNAs) into the blood. Investigation of aberrant circulating exosomal ncRNAs may provide new opportunity to discover tumor-related biomarkers. In this study, we will use next-generation sequencing、 digital PCR techniques、unique statistical approaches, and case-control study design to screen for and identify ESCC-associated plasma exosomal ncRNAs, specifically long ncRNAs (lncRNAs) and miRNAs. Then, we will compare the pre/post operation exosomal lncRNA/miRNA profiles in an independent cohort of early stage ESCC patients, to validate the specificity of ESCC-associated circulating exosomal ncRNA markers. We will further investigate the specificity and sensitivity of ESCC-specific exosomal ncRNA profiles for diagnosis of ESCC, using case-control study samples. Lastly, we will study the functional significance of specific ncRNAs in ESCC cell lines. This study will provide new insights into the molecular mechanisms of ESCC and identify novel biomarkers for early diagnosis of ESCC.

过往研究显示食管鳞癌早期患者5年生存率高于中晚期患者近10倍，然而目前只有15%的患者能够获得早期确诊，因此迫切需要更有效的早期诊断方法。近年发现肿瘤细胞能分泌大量含有非编码RNA（ncRNA）的外泌体到血循环中，检测循环外泌体内异常ncRNA分子为肿瘤早期诊断提供了新机遇。本课题将使用高通量测序、数字PCR技术和独特的数据分析方法通过病例-对照研究发现食管鳞癌相关的血浆外泌体长链ncRNA （lncRNA）及miRNA；通过观察早期食管鳞癌手术前/后血浆外泌体lncRNA/miRNA谱的变化验证有关ncRNA分子的特异性；用病例-对照研究探讨食管鳞癌特异性的外泌体lncRNA/miRNA谱早期诊断价值；最后通过体外实验探讨特异lncRNA/miRNA分子对食管鳞癌细胞表型及基因表达谱的影响，阐明其分子机制。本研究将为发现食管鳞癌新的早期诊断分子标记物，为揭示其分子发病新机制提供科学依据。

食管癌是全球肿瘤致死的第六大病因，其中90%病例为食管鳞状细胞癌(ESCC)。在临床上，由于食管癌早期缺乏典型症状以及有效的早期诊断方法，85%以上的患者确诊时已是中晚期，病人的5年平均生存率只有10-20%。因此，寻找更有效的早期诊断方法，对降低ESCC死亡率具有重要的现实意义。外泌体（exosome）是由细胞内分泌到细胞外的小囊泡。外泌体内包含有lncRNA等生物活性分子，这些活性分子为疾病诊断提供了丰富的生物学标记物。本研究采用RNA测序、定量PCR,细胞转染及共转染、基因敲除、基因过表达、原位杂交、RNA pull-down, 质谱分析、纳米颗粒递送ASO、裸鼠成瘤实验等技术，从ESCC、肝癌等病人血浆中识别、筛选与肿瘤密切相关的外泌体lncRNAs,并从细胞、分子、及整体动物水平上阐明外泌体lncRNAs的作用机制。主要成果是：1. 从全基因组水平阐明了外泌体lncRNA表达谱的特征，发现了外泌体lncRNAs比mRNAs更适合作为肿瘤生物标记物的实验证据。 2. 发现了多个与ESCC,肝癌相关的外泌体lncRNAs。 3. 在细胞水平上证明了与肿瘤相关的外泌体lncRNAs参与调控癌细胞的增殖、迁移、凋亡过程。4. 发现ESCC细胞被敲除了RP5-1092A11.2后，细胞分泌的外泌体可抑制肿瘤细胞生长。5. 筛选出了肿瘤相关的CTD-2017C7.1, LLNLR-299G3.1的主要结合蛋白。 6. 在裸鼠移植瘤模型上证明CTD-2017C7.1过表达可促进肿瘤生长，用纳米颗粒递送ASO-LLNLR-299G3.1可显著抑制食管癌移植瘤的生长。7. 发现lnc85通过与miR-324-5P8交互作用调控肝癌细胞活性。8. 发现了CTD-2017C7.1, LLNLR-299G3.1作用的靶基因；发现LLNLRLR-299G3.1作用的靶通路主要是Hippo 及Rap1信号通路，CTD-2017C7.1主要调控细胞周期及DNA复制，揭示了ESCC新的发病机制。本项目研究结果为阐明外泌体lncRNA作为肿瘤新型分子标记物及其分子机制提供了临床及实验证据。