DNA 主动去甲基化实时动态检测及调控因子研究

The study on TET (Ten-eleven Translocation) protein-mediated DNA active demethylation has raised wide interest currently. Limited by the off-line and discontinuous analytical methods, the mechanism of TET and potential regulating cofactors has not been fully confirmed. The objective of this project is to investigate the methodology for real-time analysis of DNA active methylation process and regulating cofactors. Firstly, developing long-range electron transfer based methods for real-time detection of the enzymatic activity of DNA methyltransferase (Dnmt). Secondly, studying methods for sensitive analysis of 5-hydroxy methyl cytosine (5-hmC), 5-formyl cytosine (5-fC) and 5-carboxylic cytosine (5-caC). Thirdly, building up technology for real-time detection of the enzymatic activities of TET protein and thymine DNA glycosylation (TDG) enzyme. Fourthly, by real-time detection of DNA active demethylation process, investigating the effects of regulating cofactors. The research will enrich methodology on DNA methylation, and hopefully reveal new mechanisms. The research has important theoretical significance and practical value in the aspect of clinical diagnosis, treatment and drug development.

当前，TET蛋白介导的DNA主动去甲基化及相关调控因子的研究广受关注。受限于常规离线的暂态分析方法，TET蛋白和潜在调控因子在该通路中的作用机制尚未被完全证实。本项目以建立实时动态的分析技术研究DNA主动去甲基化及其调控因子为目的。基于DNA长程电子转移原理，建立DNA甲基转移酶活性的实时检测方法；发展去甲基化过程中5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的检测方法；研究TET蛋白、胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的实时检测方法；建立DNA主动去甲基化的实时动态检测技术；研究主动去甲基化过程TET蛋白和抗坏血酸、氧气、microRNA等重要调控因子的作用方式。本项目的研究将丰富DNA甲基化研究技术，揭示新的主动去甲基化和调控因子机制，在临床诊断、疾病治疗和药物开发具有重要理论意义和实用价值。

本项目围绕DNA主动去甲基化过程，通过建立去甲基化过程中表观遗传修饰的检测方法，发展动态检测技术，研究Tet（ten-eleven translocation）酶的催化行为，以及与重要调控因子的相互作用。项目的研究取得以下几方面进展：（1）建立了系列DNA主动去甲基化过程中重要表观遗传修饰5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）定量检测方法，在实验室常规仪器上实现微量样品快速分析；（2）提出DNA去甲基化实时监测策略，有效克服当前离线的不连续分析方法的缺陷，成功揭示了Tet2酶序列偏好性来源，解决了关键调控因子抗坏血酸和O2作用去甲基化机制的争议；（3）探索了miRNA、以及其他调控因子的分析方法，创新性提出了系列高效高特异性核酸恒温扩增策略，实现单细胞、固定细胞和活细胞miRNA、总还原性物质、细胞表面pH等的灵敏检测和成像分析。研究成果发表SCI论文20篇，包括Adv. Mater. 1篇，Nucleic Acids Res. 1 篇，Anal. Chem. 6 篇，ACS Appl. Mater. Interfaces 1篇，申请专利9件，授权3件，培养硕士研究生和博士研究生8名。本项目的研究丰富了DNA甲基化研究技术，有效推动DNA甲基化诊断技术的优质化和平民化，极大降低分析成本和技术门槛，对表观遗传生物医药应用研究具有实用价值。