单分子力谱研究多因子动态调控DNA甲基化修饰循环的机理

The pattern of the methylated CpG regulates gene expression. DNMT1 (DNA methyltransferase 1) and TETs (Ten-eleven translocation) among others are involved in a dynamic circle of CpG modifications. DNMT1 converts the cytosine in CpG to 5mC (5-methylcytosine). TET2 oxidizes 5mC and gives 5hmC (5- hydroxymethylcytosine). This step is critical for the demethylation of CpG. Methylation and demethylation together form the circle of CpG modifications, however, this circle is flawed. How do DNMT1 and TET2 coordinate to modify CpG, and produce C, 5mC and 5hmC? How do the transcription factors (TFs), e.g., MLL1 and MeCP2, competing to bind a CpG? Our team designs single-molecule force spectroscopy assays based on magnetic tweezers for exploring the interactions between nucleic acids and proteins. The DNA fragments extracted from the HOXA9 locus in leukemia stem cells carry the native epigenetic markers, which serve as the binding targets of methyltransferases, demethyltransferases and TFs. Our team will examine the dynamics of individual factors recognizing CpG and the mechanisms of TFs interrupting the actions of DNMT1 and TET2. With the data generated out of this project, our team will be able to build a kinetics model for the interactions among the proteins in the circle of CpG modifications.

DNMT1和TETs等蛋白参与CpG的动态修饰循环通路。DNMT1将CpG中的C催化生成5mC。TET2氧化5mC成为5hmC。这是DNA去甲基化的关键步骤。由甲基化和去甲基化共同构成的CpG修饰循环，尚不完善。申请者追问，DNMT1和TET2如何协调CpG的次序修饰步骤，从而生成C、5mC和5hmC？诸多转录因子，譬如MLL1、RNA和MeCP2,如何与DNMT1和TETs竞争结合CpG底物？本课题组设计基于磁镊的单分子力谱实验，探测核酸与蛋白相互作用。从人白血病干细胞提取的HOXA9基因片段，携带天然的甲基化标记，可作为甲基化酶、去甲基化酶以及转录因子结合的底物。本课题组还将探测单个蛋白因子识别CpG的动态过程，以及转录因子干扰DNMT1或者TET2的机理。基于本项目的实验数据，申请者将构建CpG修饰循环中诸多因子相互作用的动力学模型。前期实验结果令人鼓舞。南开平台将强力支持项目开展。

在单分子水平探索DNA CpG甲基化模式与表观遗传蛋白互作的机制，有助于我们深入理解染色质的结构和功能，并衍生出诊断和药物设计的新技术，推动基础科研成果向临床转化。此外，单分子力学操控方法作为独特的精密测量技术，其推广应用会有助于量化生物学的发展，提升实验结果的可重复性、可靠性和精准性。本项目自主搭建了两台单分子磁镊，分别实现了高分辨率和高通量模式。制作了多套分析DNA开放末端高级结构的生物分子传感器，多套单碱基分辨率分析DNA-蛋白互作的单分子力谱生物分子传感器，以及一套直接探测蛋白-蛋白互作的单分子力谱生物分子传感器。本项目利用原子力显微镜形貌分析和单分子磁镊力学分析，探测了人白血病K562细胞中HOXA9基因CpG岛的甲基化状态对表观遗传蛋白识别和解离动力学的影响。针对转录因子MLL1，本项目还探测了其DNA甲基化修饰和基因组背景序列如何影响CXXC蛋白结构域的动态结合和解离。基于单分子动态实验数据，本项目的结果加深了我们对DNA甲基化修饰通路中诸多因子相互作用的动力学模型的理解。