高等植物耐寒基因的筛选克隆和鉴定

根据已知拟南芥抗寒基因和核苷酸序列合成寡聚核苷酸引物，用PCR技术扩增出DNA片段，克隆到pBulescripSK载体上，经测序鉴定为拟南芥抗寒基因，以此为探针，对冬小麦，菠菜和大白菜的总DNA进行Southern杂交，但未发现阳性带，同时分别以冬小麦，菠菜和大白菜和总DNA为模板，进行PCR扩增，也未发现特异条带，说明此抗寒基因具有物种特异性，将拟南芥抗寒基因克隆到真核表达载体pBI121上，转化不耐寒的烟草植物，结果仍在观察。以菠菜为材料置4℃冷室中进行耐寒处理。从中提取mRNA（同时提取未经冷处理的菠菜mRNA为对照），反转录合成cDNA为探针，筛选对冷处理的cDNA杂交呈阳性，而对照cDNA杂交呈阴性的克隆，但经若干次筛选，未获得理想的克隆。