网格蛋白轻链CLC的生物学功能及其分子作用机理研究

Clathrin is composed of clathrin heavy chains (CHC) and light chains (CLC). Clathrin-mediated endocytosis (CME), a major endocytic pathway in animal and plant cells, directly regulates many cellular processes including the uptake of extracellular nutrients, abundance of plasma membrane (PM) proteins, and transduction between extra- and intracellular signals. Previous studies have shown that loss of CLC2 and CLC3 impairs endocytosis of PIN2 auxin efflux transporter and root gravitropism but does not affect polar localization of PIN2. Moreover, loss of CLC1 causes a pollen lethality phenotype, which significantly hinders us from genetically characterizing the cellular functions of CLCs. In this study, we used the root tip-specific promoter PIN2 and antisense RNA technique and successfully generated loss-of-function clc triple mutants. Based on these results, we will focus on the following key points: (1) analyze the effects of loss of CLCs on the PM polar localization, endocytosis and recycling from/to the PM of PIN2, root gravitropism and asymmetric auxin distribution; (2) identify function roles of CLCs in the recruitment of CHCs to the PM; (3) characterize function roles of CLCs in the recruitment of clathrin adaptor proteins AP2 (adaptor protein 2) and TPC (TPLATE complex) to the PM. These analyses would deeply dissect molecular mechanisms underlying CLC regulation of endocytosis and their functional roles in PIN polar localization, which will provide new insights into the regulation mechanisms of PIN-mediated polar auxin transport in plants.

网格蛋白是由重链CHC和轻链CLC组成的复合体，其介导的内吞是动植物细胞最重要的内吞途径之一，直接调控胞外物质吸收、质膜蛋白丰度和胞内外信号传导等重要细胞生物学过程。前期研究表明，拟南芥CLC2和CLC3功能缺失影响生长素极性输出载体PIN2内吞与根尖向地性，但不影响其极性定位，而CLC1功能缺失引起花粉致死。因此轻链细胞生物学功能一直没有最后定论。本申请项目利用根尖特异性表达启动子和反义RNA抑制技术，成功制备根尖轻链功能缺失三突变体。在此基础上，拟开展以下几项研究工作：（1）分析轻链功能缺失对PIN2极性定位、内吞与回收、根尖向地性与生长素分布的影响；（2）分析轻链在重链质膜招募与装配中的调控功能；（3）分析轻链在网格蛋白接头蛋白亚基质膜招募中的作用。通过这些研究期望能深层次剖析轻链调控内吞的分子机理及其在PIN极性定位中的生物学功能，为研究PIN介导生长素极性运输机制提供新的见解。

网格蛋白介导的内吞CME (clathrin-mediated endocytosis)是质膜内吞的主要途径之一，在胞外营养物质吸收、质膜蛋白和脂质丰度及其胞内外信号传递等重要细胞生命活动过程中具有重要调控作用。网格蛋白复合体是由3条重链CHC (clathrin heavy chain)和3条轻链CLC (clathrin light chain)组成的三脚架结构。本项目拟剖析CME的调控机理从而阐明网格蛋白轻链CLC的生物学功能及其分子作用机理。目前已获得了以下主要研究结果：（1）分析了网格蛋白轻链功能缺失影响了PIN2的极性定位、PIN2内吞和质膜重回收、生长素分布、网格蛋白重链质膜招募以及接头蛋白复合体AP2和TPC质膜招募，剖析了轻链调控内吞的分子机理及其在PIN极性定位中的生物学功能。（2）初步阐明了网格蛋白轻链CLC参与蓝光诱导下胚轴向光性生长的作用机理；发现蓝光调节网格蛋白的再定位，进一步影响网格蛋白介导的PIN3的内吞和侧定位，从而造成生长素侧向分配和向光性生长，为进步一步剖析CLC如何介导蓝光信号调控下胚轴向性生长提供了遗传学和细胞学证据。（3）分析了网格蛋白在下胚轴伸长中的生物学功能；正常光照条件下，CLC通过调控下胚轴PIN3的侧定位介导生长素从下胚轴中柱分配到表皮细胞促进下胚轴伸长，为进一步分析网格蛋白在下胚轴伸长中的分子作用机理提供新的遗传学和细胞学证据。（4）利用定点突变技术，分析了CLC1候选磷酸化位点在生长素调控网格蛋白质膜招募中的生物学功能；目前已全部完成14个候选磷酸化位点突变材料的构建工作，并已分析了14个位点的生物学功能，发现了2个位点对在生长素调控CLC质膜招募中具有重要调控功能，磷酸化实验仍在分析之中。（5）介绍了拟南芥根尖免疫定位技术在网格蛋白质膜招募中的应用方法；采用网格蛋白内源特异性抗体，为剖析网格蛋白生物学功能提供了可靠准确的试验方法。（6）合作研究了SCD1/2复合体参与调控网格蛋白介导的内吞和外吐。.受本项目资助下，已发表相关学术论文SCI刊物8篇，另有1篇Plant cell稿件都已修回。培养研究生14人，正在培养19人。国际或全国性学术会议作报告1次。