生长素极性输出载体PIN内吞与极性定位分子调控机理

PIN (PIN-FORMED)-mediated polar auxin transport (PAT) is a unique manner in auxin regulation of plant growth and development. PIN endocytosis and its polar localization are an important molecular mechanism in PIN-mediated polar auxin transport out of the cell. Clathrin-mediated PIN internalization plays a key regulatory role in the establishment of PIN polar localization at the plasma membrane (PM). Based on clathrin-mediated endocytosis (CME) in mammalian cells, the binding of plant clathrin with adaptor protein2 (AP2) and in turn AP2 interaction with PM-localized PIN proteins leads to the formation of clathrin/AP2/PIN complex, and finally PIN endocytosis occurrence. However, experimental evidence is still lacking. Our previous study has revealed that clathrin light chains (CLC) regulate PIN endocytosis. In this study, genetic, cytological, physiological, and biochemical strategies will be used to further analyze molecular mechanisms underlying PIN endocytosis and its PM polar localization in Arabidopsis, which include (1) functional identification of PIN conserved internalization motifs (AP2 specific binding sites) in PIN endocytosis and its PM polar localization; (2) the functional role and molecular mechanisms of AP2-mediated PIN endocytosis; and (3) identification of tyrphostin A23 action targets in the inhibition of clathrin-mediated PIN endocytosis. The above work would deeply dissect molecular regulatory mechanisms underlying PIN-mediated polar auxin transport, which better understand auxin action mechanisms in its regulation of plant growth and development in plants and expect a higher level of original academic achievements.

PIN介导的生长素极性运输是生长素调控植物生长发育的独特方式。PIN内吞与极性定位是生长素极性运输的重要分子基础。网格蛋白介导的内吞(CME)在PIN极性定位中具有关键性调控作用。根据哺乳动物CME分子机理，植物网格蛋白与接头蛋白AP2互作，而AP2与PIN互作，形成网格蛋白/ AP2/PIN复合物，最终导致PIN内吞，但缺乏直接的实验证据。本申请项目在发现拟南芥网格蛋白轻链CLC调控PIN内吞的基础上，综合运用遗传、细胞、生化等手段，开展以下几项研究工作：（1）PIN2内吞保守基序(AP2识别位点)在PIN2内吞与极性定位中的生物学功能；（2）AP2介导PIN内吞的分子证据及其生物学功能；（3）CME抑制剂A23抑制PIN内吞的作用位点。通过这些研究深层次剖析PIN介导生长素极性运输的分子调控机理，有利于阐明生长素调控植物生长发育的作用机理，期望获得更高层次的原创性研究成果。

网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis, CME)对胞外物质吸收、质膜蛋白丰度以及胞内外信号的传递中均起着关键性调控作用。在植物细胞中，生长素极性输出载体PIN的内吞由网格蛋白和两类接头蛋白AP2复合体和TPC复合体共同介导完成。本项目拟剖析CME的调控机理从而阐明生长素极性输出载体PIN内吞与极性定位的分子机理。目前已获得了以下主要研究结果：（1）初步阐明了植物细胞内吞抑制剂(生长素、水杨酸SA和TyrA23)调控网格蛋白介导的质膜蛋白PIN2内吞的作用机理；发现生长素特异性地调控网格蛋白的质膜招募，而SA和TyrA23能同时调控网格蛋白和AP2的质膜招募，但生长素、SA和TyrA23均不影响TPC的质膜招募，为进一步从分子水平上剖析发育信号如何调控网格蛋白介导的PIN2内吞提供了细胞学证据。（2）分析了网格蛋白在下胚轴顶钩(hook)的形成与蓝光诱导的顶钩打开、向光性生长中的生物学功能；在黑暗条件下，网格蛋白通过介导PIN3的内吞从而负调控生长素最大峰值(auxin maxima)和顶钩的形成，为进一步研究黑暗、土壤颗粒以及内源发育信号生长素和乙烯如何调控CME提供了遗传学和细胞学证据；在单侧蓝光下，PHOT1/2介导的蓝光信号途径通过调控网格蛋白从而诱导PIN3的侧向定位和生长素的不对称分布，为进一步剖析下胚轴向光性分子机理提供新的见解。（3）利用分子定点突变技术，分析PIN2内吞保守基序YxxΦ和LL在PIN2极性定位和向地性生长中的生物学功能；目前已全部完成14个YxxΦ和5个LL的突变版本的构建工作，并已分析了4个YxxΦ位点的生物学功能，发现了1个YxxΦ位点对PIN2的极性定位和向地性生长具有重要调控功能，其余位点仍在分析之中。（4）合作研究了SCD1/2参与调控网格蛋白介导的膜蛋白运输和气孔细胞的分裂，一氧化氮NO信号途径参与调控PIN蛋白的内吞、质膜丰度和亚细胞定位。.受本项目资助下，已发表相关学术论文SCI刊物3篇、国内核心刊物4篇，另有2篇Plant Physiol稿件正在投稿或修改中。培养研究生5人，正在培养9人。国际或全国性学术会议作报告4次，兄弟院校作学术报告2次，承办全国性学术会议或研讨会2次。