细丝蛋白C突变通过形成细丝蛋白C聚集体或功能缺失引起扩张型心肌病的机制研究

Dilated cardiomyopathy (DCM) is a severe cardiomyopathy that accounts for 40-50% of all patients with heart failure. Therefore, finding potential molecular targets for early intervention or treatment of DCM has important clinical value. We performed whole-exome sequencing of 146 DCM patients previously. The results showed that filamin C (FLNC) was significantly associated with DCM in the whole-exome range, and DCM-related FLNC mutations are classified as non-truncating and truncating mutation. The project plan: 1) To demonstrate that the pathological phenotypes of FLNC non-truncating and truncating mutations in myocardial tissue are different using myocardial tissue samples of patients with DCM；2) Constructing FLNC point mutation and knockout cell models on behalf of non-truncating and Truncating mutations to determine whether the two mutation types can cause cardiomyocyte hypertrophy; 3) Constructing FLNC point mutation and knockout mice, to determine whether these two mutation types lead to DCM; 4) CRISPR/cas9 and AAV9 techniques were used to treat gene therapy in two mutant types of mice, respectively, to clarify that correcting point mutation or improving the expression level of FLNC can reduce or reverse the DCM phenotype. Finally, we hope to elucidate the pathological mechanisms of FLNC involved in DCM, to provide a possible molecular target for DCM clinical intervention.

扩张型心肌病（DCM）是一种严重的心肌病，占所有心衰患者病因的40-50%。因此，寻找早期干预或治疗DCM的分子靶点具有重要的临床价值。我们前期对146例DCM患者进行了全外显子测序，发现细丝蛋白C（FLNC）在全外显子范围内与DCM显著相关，并且DCM相关FLNC突变分为非截短型和截短型突变两种。本项目计划：1）利用DCM患者心肌组织样本证明FLNC非截短型和截短型突变在心肌组织中病理表型不同；2）利用FLNC点突变和敲除细胞模型分别模拟非截短型和截短型突变，明确两种突变类型是否能引起心肌细胞肥大；3）通过构建FLNC点突变和敲除小鼠，明确这两种突变类型是否导致DCM的发生；4）利用CRISPR/cas9和AAV9技术分别对两种突变类型的小鼠给予基因治疗，明确纠正点突变和提高FLNC表达后DCM表型是否减轻或逆转。最终阐明FLNC参与DCM的病理机制，为DCM临床干预提供可能的分子靶点。

1、本项目主要围绕FLNC与扩张型心肌病的关系展开研究，目前获得的初步结论如下：（1）确定了FLNC基因是中国扩张型心肌病患者重要的候选基因；（2）发现FLNC p.Lys869fs突变的扩心病患者家系，利用患者及家属诱导出人源IPS细胞系；（3）利用Crispr技术构建FLNC p.Lys869fs突变小鼠模型；（4）初步确定FLNC引起扩张型心肌病是通过激活错误折叠蛋白系统引起的，这一部分结果还在进一步验证中。本项目确定了中国扩张型心肌病重要的候选基因FLNC，并确定FLNC p.Lys869fs突变可以引起扩心病表型，为中国扩张型心肌病遗传诊断提供了新的位点，机制的研究成果可能为临床个性化治疗提供方向。基于对FLNC基因研究的不断深入，我们将FLNC在心肌病中的作用与机制进行了综述，2021年以“Filamin C in cardiomyopathy: from physiological roles to DNA variants”为题在Heart Failure Reviews上发表。.2、机制研究过程中，我们对langendorff灌流系统分离成年小鼠心肌细胞方法进行了改良优化，相关内容发表在J Cell Mol Med. 2020;24:14619–14625；对离体肌肉收缩力测定方法进行了总结和方法过程的优化，相关内容发表在Anim Models Exp Med. 2022;00:1–8。对这两种实验方法的优化为心肌病从细胞水平到离体组织水平的研究提供了更精细化的研究方法。.3、为了探索扩心病的治疗策略，我们利用体内靶向RNA的CRISPR系统进行对hTNNT2R141W点突变位点的纠正，希望在动物水平纠正突变位点，改善转基因小鼠的心脏结构和功能。我们发现CRISPR-Cas13b系统可以使扩心病转基因小鼠肌小节长度减少，钙瞬变幅度降低，钙消融能力减弱，同时心肌细胞肥大程度较未注射病毒组发生显著改善，说明CRISPR-Cas13b系统能够降低了错误RNA的表达，逆转转基因扩心病模型小鼠的扩心病表型，提示利用CRISPR-Cas13b系统可能是一种潜在的心肌病治疗手段，本部分研究结果已经整理成文，正在投稿中。