由机械力引发的细丝蛋白-平滑肌蛋白间相互作用及其分子机制研究

The long-term goal of my research is to understand the molecular mechanism of cellular mechanotransduction, a conversion of mechanical forces, such as gravity, muscle contraction, blood flow, and pressure, into biochemical signals. Mechanotransduction plays a crucial role in tissue repair and regeneration by controlling cell migration, growth, and differentiation. In this project we elucidate the role of a novel force-dependent interaction between filamin A (FLNA) and smoothelin (SMTN) in vascular smooth muscle cells (VSMCs). Vertebrate FLNA is actin-crosslinking protein that interact with multiple partners. We and others have shown that mechanical force regulates one such interaction – with integrins – by opening a cryptic binding site on FLNA. To identify other such associations, we employed mass spectrometry-based proteomics followed by in silico screening to identify additional proteins that contain the FLN binding site. We found that SMTNs (A and B) bind selectively to the open form of the FLNA integrin-binding domain. SMTN-A is abundant in visceral smooth muscle and is essential for the contractility of intestinal smooth muscle. SMTN-B is expressed in vascular smooth muscle cells, and loss of SMTN-B results in increased mean arterial pressures. Since FLNA mutations also cause cardiovascular defects, we hypothesize that the FLNA-SMTN interaction plays a critical role in VSMC contraction and mechanics, and that alterations in this interaction contribute to disease, including atherosclerosis, hypertension, and asthma. We will: 1) biochemically characterize the FLNA-SMTN interaction to obtain a high resolution structure of the complex using nuclear magnetic resonance spectroscopy or X-ray crystallography; 2) determine the mechanical properties of FLNA-actin networks in the presence of SMTN with or without mechanical force mediated by myosin contraction in vitro; 3) investigate the role of the FLNA-SMTN interaction in living cell mechanics, signaling, and behaviors such as contraction, growth, migration; 4) examine an effect of disease-causing mutations in FLNA and SMTN on their interaction and expression levels, and on VSMC function. In summary, determining the role of FLNA-SMTN interactions in normal and aberrant VSMC mechanics in cardiovascular diseases may pave the way to new therapeutics for cardiovascular and lung disease.

由机械力引发的细丝蛋白-平滑肌蛋白相互作用是由申请人发现的一种血管平滑肌细胞内平滑肌蛋白与细丝蛋白间的新型作用模式，也是细胞生物学研究领域的最新热点之一。机械力传导机理在控制细胞迁移、生长、分化以及组织修复和再生中扮演非常重要的角色。本项目通过研究该最新发现的细丝蛋白A和平滑肌蛋白间的相互作用，探索和解析由机械力引发和传导的该类细胞信号通路的生物学机理。机械力与生化信号的转化对研究重力、肌肉收缩、血压以及动脉硬化和哮喘等疾病都具有非常重要的意义。本项目的具体研究内容包括：1）解析细丝蛋白A-平滑肌蛋白复合体的三维结构；2）应用基因突变技术研究平滑肌蛋白与细丝蛋白A的相互作用对肌动蛋白网的体外物理化学性质的影响；3）研究细丝蛋白A与平滑肌蛋白相互作用的有无对细胞生长、迁移以及细胞收缩等的影响；4）探究心血管疾病中基因变异与细丝蛋白/平滑肌蛋白之间的关联性以及对平滑肌细胞功能的影响。

细丝蛋白A是一种广泛表达的肌动蛋白结合蛋白，其可以与多种蛋白结合并调控细胞生长发育，迁移和生存。细丝蛋白A在机械力诱导下，通过构象改变来暴露其位于第21重复片段上的结合位点来对机械力信号传导进行调控。.在本项目中，通过稳定同位素标记结合蛋白组学的方法，本课题组发现了平滑肌蛋白作为新型的，受机械力调控的细丝蛋白A结合蛋白。其特异性的与机械力激活形式的细丝蛋白A变体1结合， 干扰细丝蛋白A机械结合位点的突变也可以阻断平滑肌蛋白与细丝蛋白A的结合。之后，我们确定了细丝蛋白与平滑肌蛋白的结合位点，荧光漂白恢复实验显示，无细丝蛋白A结合能力的突变型平滑肌蛋白淬灭后恢复速度快于野生型平滑肌蛋白。这些数据显示，在活细胞中，平滑肌蛋白特异性的与机械激活的细丝蛋白A变体1相结合。.由于细丝蛋白A与平滑肌蛋白的结合涉及多个结构域，因而难以产生缺乏细丝蛋白A和平滑肌蛋白相互作用的转基因小鼠。同时我们也尝试生产蛋白片段去进行结构分析，但均难以溶解。.此外，本课题组还发现LUZP1基因的表达产物也特异性的与细丝蛋白A的机械力敏感结合位点结合并将其命名为fimbacin（filamin mechanobinding actin cross-linking protein，细丝蛋白机械结合与肌动蛋白交联蛋白）。我们确定了fimbacin上两个细丝蛋白A的结合位点及关键氨基酸并发现fimbacin也是一个肌动蛋白交联蛋白。其与肌动蛋白结合位点位于第400-第500个残基之间。在细胞中进行外源性表达时，fimbacin被定位在细胞内的肌动蛋白应力纤维上。其与细丝蛋白A的相互作用可以稳定其与纤维状肌动蛋白的共定位。上述结论确定了fimbacin是一个新型的肌动蛋白交联蛋白，其可以与FLNA机械力响应结构域R21相互作用。.综上所述，在本项目中，我们发现了两种新型的细丝蛋白A机械力结合蛋白，并部分阐明了其结合机理，上述成果已发表在biochemistry期刊上，我们感谢国家基金委的慷慨资助，本课题组现在将继续致力于机械力信号传导研究领域，发现并表征其他的细丝蛋白A结合蛋白，进一步揭示机械力信号传导在细胞生命历程中的功能。