双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能研究

真核生物的Serpin家族是一类多肽类的丝氨酸蛋白酶抑制剂，参与纤溶、炎症反应、细胞迁移和分化以及凋亡等许多重要的生命活动。原核生物中特别是细菌中的serpin的功能研究只有少量的报道。06年有学者发现长双歧杆菌的细胞表面存在Serpin，起着保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化等作用。然而Serpin基因在双歧杆菌中的分布、起源及其与宿主间的相互作用机理仍是未知的领域。申请人拟从保藏的双歧杆菌菌株中筛选含有Serpin基因序列的菌株，克隆其基因，并构建Serpin原核表达系统和缺失突变株，确证Serpin参与黏附以及对肠上皮细胞产炎症因子的影响，从而提出双歧杆菌定植肠道的可能黏附机制模型以及抗炎症的作用机理，为进一步揭示双歧杆菌与宿主的相互作用的分子机制作出贡献。

双歧杆菌是人体胃肠道的原籍菌和优势菌，2006年瑞士雀巢研究发现长双歧杆菌的细胞表面存在丝氨酸蛋白酶抑制剂-serpin（serine protease inhibitor），可为双歧杆菌黏附于肠道提供条件。本研究从18株7个种的双歧杆菌中克隆到3个serpin基因，分析了其基因序列和氨基酸序列。通过构建serpin的原核表达载体pBX2-WBBI02体外表达纯化serpin蛋白，实验证明serpin在体外能有效地抑制糜蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性，显微观察结果证实serpin能促进双歧杆菌对HT-29细胞的粘附。考察了长双歧杆菌WBL001菌体生长状态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等因素对制备双歧杆菌原生质体的影响，获得了长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件。在此基础上，通过原生质体的PEG介导转化，将构建的双歧杆菌serpin基因的置换型打靶载体UPD导入双歧杆菌，利用UPD敲除了双歧杆菌的serpin基因，并对该基因缺失株的体外细胞粘附能力进行了分析研究，发现serpin缺失对双歧杆菌的黏附没有很大影响。本研究成功建立了双歧杆菌转化系统和基因敲除系统，为双歧杆菌的基因操作及基因功能研究提供了新方法。