肺鳞癌致病基因的识别及肺癌细胞的起源和演化规律探讨

It is widely controversial on whether tumor cell derived from monoclonal or polyclonal cell in recent years. The origin of lung cancer remains unknown. Using the second generation of gene sequencing platform, we conducted the whole-exome sequencing of a lung squamous carcinoma, and found seven potential lung cancer genes, including two well-known lung cancer genes TP53 and EP300 gene, and five new potential genes. By comparing the mutation of these seven genes in tumor cells which collected from different sites of the lung cancer tissue by microdissection, we found that lung cancer cells may be derived from polyclonal cells. Further, basing on these findings, we intend to conduct the following research: 1. In the 98 non-small cell lung cancer samples we collected, 13 cases carring mutant TP53 and 5 cases carring mutant EGFR gene will be sellected and furhter conduct whole-exome sequencing, in order to identify the new lung cancer genes. 2. The lung cancer genes identified in this study will be selected and geneotype in tumor tissues collected from different sites of one sample by microdissection, or sequence the single tumor cells by whole-exome sequencing, to investigate the origina and progression of lung cancer cell. 3. The tumor gene mutations emerge time and spatial course in tumour cells derived from identity progenitor cell will be revealed by analyzing the distribution of the gene mutations in these cells.

肿瘤细胞发生是单克隆起源还是多克隆起源是近年来争议的研究领域，肺癌是否存在多克隆起源了解尚少。我们通过全基因组外显子测序技术，对一例肺鳞癌患者进行研究，发现了7个可能的肺癌致病基因。通过对肺癌不同部位的肿瘤细胞携带这7个致病基因突变的研究，发现肺癌的肿瘤细胞可能是多克隆起源的。进一步在我们这些发现的基础上，进行以下研究：1.在我们收集98例肺癌病人，并完成13例携带TP53基因突变的肺鳞癌全基因外显子测序的基础上，进一步挑选5例携带EGFR基因突变的肺癌病人的全外显子组测序研究，识别和鉴定肺癌的新的致病基因。2. 以这些发现的肺癌致病基因为分子标志，通过显微切割和肿瘤细胞的单细胞全外显子组测序，进一步验证肺癌组织中，肿瘤细胞是单克隆还是多克隆起源。3. 通过对同一克隆起源的肿瘤细胞内，携带的肺癌致病基因突变的分布分析，探讨肿瘤细胞内这些肿瘤致病基因突变发生的时空顺序。

摘要.既往认为肺癌发生是单克隆起源，在同一个患者的肺癌细胞中，都携带相同的致病基因突变。.本研究通过对13例携带TP53基因突变的肺癌患者的癌组织和癌旁组织的全基因/全基因组外显子测序，识别鉴定肺癌患者中携带体细胞突变，发现在13例肺癌患者中，有2217个突变基因。平均一例病人含有170个突变基因。通过我们开发的新的生物信息学方法，发现其中152个基因在肺癌中突变的频率远远高于正常人群，提示这些基因可能是肺癌的候选致病基因。挑选其中的6个可能与肿瘤发生相关的基因，进行扩大样本验证，发现其中4个基因至少有1例以上病人中有突变，且在肺癌人群中突变率大于3%（UNC5D，7.9%、PREX1，5.0%、HECW1，4.0%和GPC5，3.0%），表明这4个基因可能是肺癌的致病基因。挑选UNC5D基因上的6个改变氨基酸位点的突变，发现这些突变位点，可以使UNC5D抑制肿瘤发生的功能消失，证实其突变可能促进了肿瘤的发生。.以我们在13个携带TP53基因突变的肺癌中发现的152在肺癌病人突变频率高于正常人群的基因为分子标志，通过显微切割技术，对这13例肺癌肿瘤细胞的克隆进化和起源进行分析。发现同一个患者不同部位的肿瘤细胞携带不同的致病基因突变，存在肿瘤的异质性。TP53基因突变在肺癌发生中，不是一个早期的分子事件。而在肺癌组织中，即存在肿瘤特定致病基因的缺失，也存在同一个肿瘤致病基因的突变，这为肿瘤发生的二次打击学说提供了直接的证据。.通过对已知致病基因在肺癌患者中的突变筛查，发现我国肺癌人群中，突变频率最高的是TP53基因(41.6%)，其次是EGFR (11.9%)。而肺腺癌和鳞癌中常见致病基因突变是不同的， EGFR 突变主要在肺腺癌中出现，而TP53突变主要在肺鳞癌中出现。同时，我们还发现3个在肺鳞癌中常见的致病基因突变，分别是CDKN2A（18.6%，8/43）、KEAP1（11.6%，5/43）和NFE2L2（16.3%，7/43），在肺腺癌中很少突变。KEAP1和NFE2L2的突变在肺鳞癌中是相斥的。这2个基因在肺鳞癌中的突变频率高达27.9%，这为开发肺鳞癌的靶向治疗新药奠定了基础。