肺癌新致病基因的识别与KEAP1/NRF2基因突变的肺癌靶向药物筛选

Recently, the advent of target therapy has dramatically revolutionized the anticarcinogen therapy of NSCLC cancer, and became emerging to be the hot topic on the cancer research. However, no target drugs treatment squamous cell lung carcinoma have been used in clinical. Using a novel bioinformatics analysis process, which were pioneered and formulated by ourselves, we identified somatic gene mutations in 13 NSCLC patients and confirmed them in an extended validation group of 90 people by targeted sequencing. Our results showed that among the 27 candidate lung cancer driver genes, totally 16 genes carrying a somatic mutation with the mutation rate >3%, including 4 novel driver mutation genes for lung cancer. Intriguingly, we found that Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) gene mutations occurred in 27.9% squamous cell lung carcinoma samples. Based on these significative founding above, we performed our research from three aspects: 1) We confirm the above 27 candidate lung cancer driver genes in a large cohorts of 400 NSCLC patients by targeted sequencing to identify novel driver mutaiton genes. 2) Verify the high mutation rate in lung squamous-cell carcinoma of KEAP1, NRF2 genes. Clarified the role of KEAP1 /NRF2 genes mutations in the tumorigenesis of NSCLC and idetified the mechinism of KEAP1 /NRF2 genes mutations promoting tumorigenesis of lung cancer. 3) Observed the different response of the NSCLC cell lines with or without KEAP1 /NRF2 genes mutations to the Nrf2 inhibitor, in order to calrify whether Nrf2 inhibitor could be a target therapy drug specific to NSCLC patients carrying KEAP1 /NRF2 genes mutations.

靶向治疗是肿瘤研究的热点方向，但肺鳞癌缺乏靶向治疗的药物。我们通过对13例携带TP53 基因突变的肺鳞癌全基因外显子测序，结合课题组开发的新算法，挑选27个可能的肺癌致病基因，在扩大的90例病人中进行验证，发现突变频率>3%的有16个，包括4个新的肺癌致病基因。同时发现KEAP1/NRF2基因是肺鳞癌中常见的突变基因（27.9%）。进一步在我们这些发现的基础上，进行以下研究：1.在收集的400例肺癌石蜡样本中，对发现的候选基因进行验证，识别鉴定新的肺癌致病驱动基因。2. 在大样本人群中明确KEAP1 /NRF2是否是肺鳞癌中常见的突变基因，通过对发现的KEAP1 /NRF2基因突变位点功能的研究，明确KEAP1 /NRF2基因突变在肺癌发生中的作用及其促进肺癌发生的分子机制。3. 筛选有效的NRF2抑制剂，并明确其是否可以作为携带KEAP1 /NRF2基因突变的肺鳞癌患者的特异性靶向治疗药

项目组在前期工作的基础上，通过四个层面探索KEAP1/NRF2 基因在非小细胞肺癌的发生发展可能起到的重要作用，以及其突变是否可以作为靶向治疗的靶点：.1）在前期研究工作中，利用新一代测序技术寻找非小细胞肺癌体细胞高频突变基因，并在扩大样本中对候选基因进行外显子测序，识别、鉴定非小细胞肺癌的可能的新致病基因，验证 KEAP1 /NRF2 基因是肺鳞癌中的高频突变基因；.2）对我们研究已经发现的在肺鳞癌中高频突变的 KEAP1 /NRF2 基因进行功能分析研究，从体内外水平进一步探索 KEAP1 /NRF2 基因突变在肺癌发生中对NRF2 下游抗氧化反应元件（ARE）、解毒及细胞代谢相关基因（如 UGTA1A、NQO1 及 GSTA 等）的转录水平的影响，并探讨其对氧化应激水平的影响。结果证实KEAP1 /NRF2 基因体细胞突变致使KEAP1基因功能丧失、或NRF2基因激活，并改变氧化应激水平，进而参与了非小细胞肺癌的发生，从而在整体水平了解 KEAP1 /NRF2基因在非小细胞肺癌发生中的作用和贡献；.3）从细胞与动物水平比较我们发现的在非小细胞肺癌中突变的KEAP1/NRF2 与野生型基因的功能差别，明确了在肺癌组织中发生的体细胞突变通过影响氧化应激通路，使细胞的增殖能力提高，克隆形成能力增强，促进肺癌的发生发展，从而从基因功能上进一步证实我们发现的高频突变的 KEAP1 /NRF2 基因是肺癌的一个新的致病基因，并明确其导致肺癌发生发展的分子机制。.4）根据文献报道挑选安全有效的 NRF2 抑制剂ML385，比较携带 KEAP1 /NRF2基因突变和不突变的肺癌细胞株，给予外源性的 ML385后，携带不同突变类型的肺癌细胞株氧化应激水平是否有差异，肿瘤细胞的生长增殖、迁移侵袭及裸鼠成瘤等能力是否有明显差异，结果：明确 NRF2 抑制剂ML385较低剂量等级时，可以抑制携带KEAP1 /NRF2基因突变的细胞株的生长和迁移能力，在细胞水平表明NRF2抑制剂ML385可以作为特异性针对 KEAP1 /NRF2 基因突变的肺鳞癌的靶向治疗药物。.此外，我们也对前期研究发现的高频突变基因UNC5D，其编码蛋白丧失了抑制肿瘤作用从而促进肿瘤的发生，表明生理状态下UNC5D具有抑癌作用。