副猪嗜血杆菌磷酸葡萄糖变位酶功能及其与脂寡糖合成关系的研究

Haemophilus parasuis (HPS) is an important respiratory-tract pathogen in swine. lipo-oligosaccharide (LOS) of HPS plays an important role in induction of pro-inflammatory reaction and pathogenesis. However, the molecular mechanism of its biosynthesis and regulation has yet to be further investigated. We found a HPS gene annotated manB is predicted to encode phosphomannomutase (PMM) in the genome sequenced strain SH0165 (HAPS_0849). Nevertheless, its expression product showed phosphoglucomutase activity (PGM) according to our preliminary data. Disruption of manB result in HPS LOS deficiency. We speculate that HPS manB plays a vital part in LOS synthesis and pathogenesis. In this study, manB mutant and its complemented strains will be constructed to analyze gene functions and its roles in LOS synthesis, as well as to confirm its effect on HPS serum resistance and induction of pro-inflammatory cytokines in porcine alveolar macrophages. This work will be of great significance to further understand the basic biology and pathogenic mechanism of H. parasuis. Moreover, characterization of HPS ManB protein including critical sites can provide potential novel target for design of new antibacterial agents, which will contribute to HPS prevention and control.

副猪嗜血杆菌（HPS）是一种危害全球养猪业的重要病原细菌。脂寡糖（LOS）在HPS诱导宿主炎症反应和致病过程中起重要作用，但其合成和调控的分子机制仍有待深入研究。申请人前期研究发现预测编码磷酸甘露糖变位酶（PMM）同源基因manB的表达产物具有磷酸葡萄糖变位酶（PGM）功能，其缺失会影响LOS结构。推测manB基因参与LOS合成，并在致病过程中发挥作用。本项目拟构建相关缺失及互补菌株，深入研究HPS manB的生物学功能，解析其在LOS合成过程中的作用，探索其缺失对HPS抗补体杀伤及诱导宿主细胞炎性因子表达的影响，对HPS基础生物学和致病机制的研究有重要意义。此外，通过表达纯化ManB，揭示其催化机制及分子基础，定位关键活性位点，为HPS的防控寻找新的切入点，为新型抗菌药物的开发提供靶标及理论依据。

副猪嗜血杆菌（HPS）是一种危害全球养猪业的重要病原细菌。脂寡糖（LOS）在HPS诱导宿主炎症反应和致病过程中发挥着重要作用，但其合成和调控的分子机制仍有待深入研究。项目负责人前期研究发现预测编码磷酸甘露糖变位酶（PMM）同源基因manB（测序菌株SH0165中基因座为HAPS_0849）的表达产物具有磷酸葡萄糖变位酶（PGM）功能，其缺失会影响LOS结构。推测manB基因参与LOS合成，并在致病过程中起重要作用。项目负责人之前的研究发现HPS的galU和galE基因缺失会提升菌体对血清的敏感性，表明半乳糖合成代谢途径相关基因是HPS多种多糖形成所必须的。本项目中我们评估了manB基因在LOS合成中的作用，发现manB的缺失导致菌体产生高度缺失的LOS分子，尽管一小部分完整的LOS依然存在于突变株中，但突变株比亲本菌株对血清更加敏感。课题组对HPS manB基因进行克隆及表达纯化，通过酶活测定证实该基因编码产物具有磷酸葡萄糖变位酶（PGM）活性。通过在manB突变株中异源表达大肠杆菌pgm基因能恢复野生型LOS的合成进一步表明HAPS_0849具有PGM功能。此外，manB缺失后在体外没有额外添加葡萄糖的条件下会导致菌体发生自凝集现象和形成更多的生物被膜。同时课题组也发现manB、galU和lgtB的突变株具有相似的LOS截短表型，而galE和lex-1的突变体则展示另一种缺陷的LOS表型，表明manB在多糖合成的过程中处于galU的上游，起关键的控制作用。最后我们研究了manB突变株的其他抗逆表型及其LOS对细胞因子产生的影响，发现结果与之前报道的LOS突变株的表型相一致。本项目通过研究HPS manB的生物学功能，构建相关菌株分析其在LOS合成与致病过程中的作用及可能的分子机制，对HPS基础生物学和致病机制的研究有重要理论价值。此外，通过表达纯化ManB，揭示其催化机制及分子基础，为HPS的防控寻找新的切入点，为新型抗菌药物的开发提供靶标及理论依据。